产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是引发幼畜,尤其是断奶仔猪腹泻的主要病原菌,被ETEC感染后的仔猪常因剧烈水样腹泻迅速脱水死亡,具有很高的发病率和死亡率,给养猪业带来了严重的经济损失。而菌毛(黏附素)K88是ETEC引发腹泻最重要的毒力因子之一。K88+ETEC侵入宿主肠道后,通过黏附素K88与宿主细胞表面受体特异性结合,从而介导细菌定居、繁殖、肠毒素分泌及适当途径的肠毒素传递,导致腹泻。实验根据GeneBank上已公布的一株Ecoli上的sepA基因序列,设计一对引物以扩增检测K88ac+产肠毒素大肠杆菌国内标准株C83902 (Wild-type, O8:H87:H19)中的sepA基因,根据实验菌株的sepA序列设计缺失引物,该缺失引物5’端与sepA两翼序列同源,3’端与质粒pKD3上cat基因两翼序列同源。以质粒pKD3为模板,应用缺失引物扩增出中间为cat抗性基因片段、两端与sepA基因上下游同源的DNA片段。将其融合片段导入含有质粒pKD46的C83902菌株内,在三种重组酶的作用下,实现氯霉素抗性基因片段与sepA发生同源重组,在氯霉素抗性平板上挑取单菌落并进行PCR鉴定,筛选出一次同源重组菌C83902△sepA::cat。将质粒pCP20导入一次同源重组菌内,通过利用其编码的Flp重组酶,进行氯霉素抗性基因的消除,经PCR鉴定与测序验证,成功构建出C83902缺失株：C83902△sepA。IPEC-J2细胞的体外黏附实验结果表明,sepA基因缺失株比野生株的黏附能力下降55.3%；通过Real-Time PCR实验检测分析sepA基因缺失株主要毒力因子转录量的变化,结果发现鞭毛(fliC)、菌毛(faeG)、热不稳定肠毒素(eltB)、溶血素(hlyA)、Ⅰ型菌毛(fimA)基因的表达量与野生株无明显差异；通过兔回肠结扎实验,观察到缺失株较野生株肠段积液量更多,且缺失株导致回肠的病理变化更为严重。综合上述实验结果,SepA在介导C83902对宿主细胞黏附的过程中起到了一定作用,而SepA可能会抑制C83902肠毒素的分泌量,达到与宿主长期共存的目的。