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背景乳酸杆菌是人体中一种非常重要的益生菌,其生物学作用包括生物拮抗,营养作用,免疫调节,抗肿瘤,抗衰老等作用。乳酸杆菌通过其特异的细胞组分与宿主的免疫细胞相互作用而发挥免疫调节功能。肽聚糖(peptidoglycan)也称黏肽(mucopeptide),是乳酸杆菌细胞壁结构和理化性质的主要功能性物质。肽聚糖的基本结构是由N-乙酰葡萄糖(GlcNAc)和N-乙酰胞壁酸(MurNAc)通过β-1,4糖苷键连接,每个N-乙酰胞壁酸(MurNAc)又连接一个四肽侧链,每个四肽侧链又通过一个五聚甘氨酸组成的肽交联桥(peptide across bridge)连接,肽聚糖是一类由共价键连接,包围整个细菌细胞壁的囊状大分子(sac-liked macromolecule)。近年来,肽聚糖的生物活性一直受到关注。Toll样受体(Toll like receptor,TLR)属于膜识别受体,是近年发现的一种膜表面受体。TLR样受体通过上调抗原递呈细胞表面的共刺激分子及抗原递呈细胞分泌的细胞因子,诱导T和B淋巴细胞向效应T和B淋巴细胞分化,进而调节获得性免疫。TLRs可以识别微生物所特有的保守结构,这类保守结构称为微生物相关保守分子(pathogen associated molecular pattern,PAMP)。肽聚糖是乳酸杆菌含量最丰富的MAMP之一,可能通过TLRs的识别而发挥免疫作用。目的本文以大连医科大学微生物教研室分离的一株乳酸杆菌DM9811为研究对象,通过提取其细胞壁的主要成分肽聚糖,观察肽聚糖对小鼠巨噬细胞Ana-1的免疫调节作用,为进而探索肽聚糖发挥免疫调节作用的分子机制提供实验基础。方法1、肽聚糖的分离纯化收集培养48小时的乳酸杆菌DM9811菌体,经10%三氯乙酸煮沸20分钟和含有4%SDS的PBS煮沸30分钟后,再用胰酶消化48小时,离心收集的沉淀即为肽聚糖粗提取物。肽聚糖粗提取物进一步溶菌酶酶解后,经葡聚糖凝胶SephacrylS-300HR进行分离和部分纯化。2、肽聚糖鉴定应用苯酚-硫酸法测定总糖含量,对二甲氨基苯甲醛显色联合溶菌酶水解实验测定N-乙酰葡萄糖,测定酶解过程中溶液吸光度的变化情况来鉴定肽聚糖。3、肽聚糖的免疫活性肽聚糖处理小鼠巨噬细胞Ana-1前后,分别1)应用酶联免疫吸附剂测定法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测培养上清中的IL-10,IL-12和TNF-α的蛋白水平;2)在活细胞染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酸亚胺酯(CFSE)标记小鼠巨噬细胞Ana-1后,流式细胞术检测小鼠巨噬细胞Ana-1的增殖分裂;3)流式细胞术检测肽小鼠巨噬细胞Ana-1细胞表面TLR2和TLR4的表达。结果1、应用三氯乙酸和SDS煮沸以及胰酶酶解得到肽聚糖,经苯酚-硫酸法,对二甲氨基苯甲醛显色,溶菌酶水解实验鉴定,凝胶过滤层析显示从乳酸杆菌DM9811获得了分子量相对均一的肽聚糖。2、ELISA结果显示所提取的肽聚糖可以促进小鼠巨噬细胞Ana-1分泌IL-10,IL-12,而低浓度的肽聚糖可以促进TNF-α分泌;流式细胞技术检测结果显示,与对照组相比,肽聚糖处理的巨噬细胞Ana-1分裂代数明显增加,同时细胞表面TLR2和TLR4(主要是TLR4)表达均显著提高。结论乳酸杆菌DM9811肽聚糖提取物表现在体外激活小鼠巨噬细胞Ana-1的免疫活性。