论文部分内容阅读
目的:利用基因芯片技术,分析不同年龄APP/PS1小鼠和C57BL/6小鼠海马组织中lncRNAs的差异表达,并挑选出显著差异的lncRNAs进行qRT-PCR验证,选取关键的lncRNA,体外实验验证其与AD相关病理的关系,进一步加深对AD发病机制的认识及为AD的治疗提供理论基础。方法:1.基因芯片筛选不同年龄（3周龄、3月龄、6月龄、9月龄）APP/PS1小鼠和C57BL/6小鼠海马组织中差异表达的lncRNAs,选出四个显著高表达的lncRNAs进行qRT-PCR验证,确定研究目标lncRNA N91,即在不同年龄（3周龄、3月龄、6月龄、9月龄）APP/PS1小鼠的海马组织中显著高表达,且其表达量与年龄呈正相关。2.研究lncRNA N91与AD相关病理的关系。选用N2a细胞系和AD模型细胞:N2a/APP695细胞系,即稳定转染了人APP695突变基因的N2a细胞系,通过qRT-PCR验证lncRNA N91在两种细胞系中的表达水平,进一步确定lncRNA N91是AD的差异基因。3.请汉恒生物有限公司构建lncRNA N91慢病毒,我们通过病毒感染及puro筛选,构建稳定高表达lncRNA N91的N2a细胞系及lncRNA N91降低的N2a/APP695细胞系,并利用qRT-PCR检测lncRNA N91的表达水平,验证细胞系是否构建成功。4.设计实验分组:N2a-lncRNA NC、N2a-lncRNA N91;N2a/APP695-shRNA NC、N2a/APP695-shRNA N91。ELISA检测细胞Aβ1-40、Aβ1-42的表达水平;通过western blot检测总tau蛋白和磷酸化tau蛋白的表达水平;免疫荧光检测细胞MAP-2来标记细胞突起的长度;流式细胞术检测细胞凋亡。结果:1.芯片结果:APP/PS1小鼠组与C57BL/6小鼠组比较,差异表达的lncRNAs2268个,其中1034个上调的lncRNAs,1234个下调的lncRNAs。通过qRT-PCR对高表达的lncRNAs进行验证,筛选到在APP/PS1小鼠的海马组织中差异显著高表达的lncRNAN91,且其表达量与小鼠年龄呈正相关;与对照组相比,lncRNA N17在APP/PS1小鼠海马组织中高表达,但其表达量是一个先升高后降低的过程;lncRNA N15在小鼠3周龄和3月龄时其在APP/PS1小鼠海马组织中的表达水平无差异性（p＞0.05）;lncRNA N18在小鼠3周龄其在APP/PS1小鼠海马组织中的表达水平无差异性（p＞0.05）。2.LncRNA N91在两个细胞系均有表达,但在N2a/APP695细胞系中lncRNA N91的表达水平显著高于N2a细胞系（p＜0.001）。3.过表达lncRNA N91的N2a细胞系中lncRNA N91的相对表达显著上调（p＜0.001）;敲低lncRNA N91的N2a/APP695细胞系中lncRNA N91的相对表达显著下调（p＜0.001）。4.N2a细胞过表达lncRNA N91后,细胞Aβ1-40、Aβ1-42、p-tau蛋白表达增加（p＜0.001、p＜0.05、p＜0.05）;细胞突起缩短（p＜0.001）;细胞凋亡率升高（p＜0.001）。5.N2a/APP695敲降lncRNA N91后,细胞Aβ1-40、Aβ1-42、tau、p-tau蛋白表达降低（p＜0.01、p＜0.001、p＜0.001、p＜0.001）;细胞突起伸长（p＜0.05）;细胞凋亡率下降（p＜0.01）。结论:1.LncRNA N91在APP/PS1小鼠海马组织中高表达,且其表达量与小鼠年龄呈正相关。2.LncRNA N91在N2a/APP695细胞系中的表达水平显著高于N2a细胞系。3.在N2a细胞中高表达lncRNA N91能够导致细胞p-tau、Aβ1-40、Aβ1-42蛋白表达增加,细胞突起缩短,细胞凋亡率升高。4.在N2a/APP695细胞中敲低lncRNA N91,能够使N2a/APP695细胞tau、p-tau、Aβ1-40、Aβ1-42蛋白表达降低,细胞突起伸长及细胞凋亡率下降。