目的（1）通过BALB/c小鼠急性毒性实验、一般药理学实验、基因表达蛋白分布实验,Wistar大鼠长期毒性实验,初步评价携带KGF和HIF-1ɑ双基因的减毒沙门氏菌TPKH以及携带NK4和IL-2双基因的减毒沙门氏菌TPIN的安全性。（2）探讨携带双基因的减毒沙门氏菌TPKH及TPIN对小鼠细胞免疫和小肠黏膜免疫的影响。方法（1）TPKH及TPIN小鼠急性毒性实验。不同剂量(1.0×10⁸、1.0×10⁹、1.0×10¹⁰cfu/0.1mL·只)TPKH或TPIN灌胃后观察对小鼠精神状态、体重的影响;灌胃后第14天进行血常规、肝功肾功指标及脏器指数的检测,并取对照组和高剂量灌胃组小鼠(1.0×10¹⁰cfu/0.1mL·只)心、肝、脾、肺、肾及胃肠组织,制作病理切片,观察各脏器组织形态。（2）TPKH及TPIN一般药理学实验。不同剂量（1.0×10⁷、1.0×10⁸、1.0×10⁹cfu/0.1mL·只）TPKH或TPIN灌胃后观察对小鼠一般行为、自发活动以及协调运动的影响。（3）TPKH及TPIN基因表达蛋白分布实验。对照组小鼠用0.1mL10%NaHCO₃灌胃,实验组小鼠用1.0×10¹⁰cfu/0.1mL·只TPKH或TPIN灌胃,分别于灌胃后0、12、24、48、72、96小时各取小鼠4只,取心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、肌肉、脑组织并制备成匀浆液,通过ELISA检测TPKH灌胃后各组织中KGF、HIF-1α蛋白以及TPIN灌胃后各组织中HGF（NK4为HGF的拮抗剂）、IL-2蛋白的表达水平。（4）TPKH及TPIN大鼠长期毒性实验。对照组用0.5mL10%NaHCO₃灌胃,实验组不同剂量(1.0×10⁷、1.0×10¹⁰cfu/0.5mL·只)TPKH或TPIN灌胃,每周灌胃2次,连续灌胃7周。分别于末次灌胃后的第1天、4周、8周、12周、16周各取大鼠4只进行血常规、血清生化指标、凝血四项、脏器指数的检测,并取末次灌胃后第12周对照组和高剂量灌胃组(1.0×10¹⁰cfu/0.5mL·只)大鼠心、肝、脾、肺、肾及胃肠组织,制作病理切片,观察各脏器组织形态,此外,取末次灌胃后的第1天对照组、第1天高剂量组、第4周高剂量组粪便标本进行16s rRNA测序。（5）TPKH及TPIN小鼠细胞免疫实验,对照组用0.1mL10%NaHCO₃灌胃,实验组分别用1.0×10⁹cfu/0.1mL·只TPKH或TPIN灌胃,每周灌胃2次,灌胃4周,于末次灌胃后1周,收集全血,用流式细胞仪检测抗凝全血中CD3⁺T、CD3⁺CD4⁺T、CD3⁺CD8⁺T水平;肠黏膜免疫实验中,对照组用0.1mL10%NaHCO₃灌胃,实验组用1.0×10⁹cfu/0.1mL·只TPKH或TPIN灌胃,共灌胃2次,间隔7天,于第二次灌胃后第14天取小鼠12只,取小肠派伊尔结（PP结）和肠系膜淋巴结,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测B细胞活化转录因子（GATA3、PAX5）的表达情况,第28天取小鼠12只,取小肠黏膜,用ELISA检测小肠黏膜中IgA表达量。结果（1）急性毒性实验期间各组小鼠精神状态良好,体重差异不显著（P>0.05）,各组小鼠的血常规、肝功肾功指标及脏器指数差异均不显著（P>0.05）;病理切片结果显示,高剂量组的心脏、肝脏等脏器组织均无病理性改变。（2）一般药理学实验结果显示,各剂量组TPKH或TPIN对小鼠一般行为均无明显影响,对小鼠自发活动、协调运动无明显影响（P>0.05）。（3）基因表达蛋白分布实验中,ELISA结果显示,与对照组相比,TPKH在灌胃后12、24、48、72、96小时,KGF、HIF-1ɑ蛋白在胃肠组织中能够显著表达（P<0.05或P<0.01）,TPIN在灌胃后12、24、48、72、96小时,HGF、IL-2蛋白在胃肠组织中能够显著表达（P<0.05或P<0.01）,而在心脏、肝脏等其他组织中各目的蛋白的表达与对照组相比差异不显著（P>0.05）。（4）长期毒性实验中,末次灌胃后的观察期内,各组大鼠均无明显的中毒反应及死亡情况;各剂量组大鼠体重均正常增长,与对照组相比差异不显著（P>0.05）;各剂量组血常规、凝血四项、脏器指数与对照组相比,差异均不显著（P>0.05）,血清生化指标除末次灌胃后的第1天ALP检测值与对照组比较有差异（P<0.05或P<0.01）外,其余检测指标各剂量组与对照组相比,差异均不显著（P>0.05）;末次灌胃后第12周病理切片结果显示,与对照组相比,高剂量组心脏、肝脏等脏器组织均无明显的病理性改变;还发现TPKH灌胃后,能提高肠道益生菌的丰度,对肠道菌群产生有利的影响,TPIN灌胃后,对肠道菌群有一定的影响,但随着时间延长,影响均逐渐减弱。（5）细胞免疫实验中,流式细胞仪检测结果显示,与对照组相比,TPKH、TPIN灌胃组均可促进CD3⁺T、CD3⁺CD4⁺T细胞的活化增殖（P<0.05或P<0.01）,提高CD3⁺CD4⁺/CD3⁺CD8⁺比值（P<0.05）;肠黏膜免疫实验中,qRT-PCR结果显示TPKH或TPIN灌胃后均能够促进GATA3及PAX5的表达（P<0.05或P<0.01）,ELISA结果显示与对照组相比,TPKH、TPIN灌胃组小肠黏膜IgA表达量显著增加（P<0.01）。结论（1）初步观察到TPKH及TPIN在动物实验中是安全的,未发现有明显毒性作用。（2）TPKH及TPIN能够促进小鼠细胞免疫,还可以增强小鼠的小肠黏膜免疫。