论文部分内容阅读
目的(1)通过BALB/c小鼠急性毒性实验、一般药理学实验、基因表达蛋白分布实验,Wistar大鼠长期毒性实验,初步评价携带KGF和HIF-1ɑ双基因的减毒沙门氏菌TPKH以及携带NK4和IL-2双基因的减毒沙门氏菌TPIN的安全性。(2)探讨携带双基因的减毒沙门氏菌TPKH及TPIN对小鼠细胞免疫和小肠黏膜免疫的影响。方法(1)TPKH及TPIN小鼠急性毒性实验。不同剂量(1.0×108、1.0×109、1.0×1010cfu/0.1mL·只)TPKH或TPIN灌胃后观察对小鼠精神状态、体重的影响;灌胃后第14天进行血常规、肝功肾功指标及脏器指数的检测,并取对照组和高剂量灌胃组小鼠(1.0×1010cfu/0.1mL·只)心、肝、脾、肺、肾及胃肠组织,制作病理切片,观察各脏器组织形态。(2)TPKH及TPIN一般药理学实验。不同剂量(1.0×107、1.0×108、1.0×109cfu/0.1mL·只)TPKH或TPIN灌胃后观察对小鼠一般行为、自发活动以及协调运动的影响。(3)TPKH及TPIN基因表达蛋白分布实验。对照组小鼠用0.1mL10%NaHCO3灌胃,实验组小鼠用1.0×1010cfu/0.1mL·只TPKH或TPIN灌胃,分别于灌胃后0、12、24、48、72、96小时各取小鼠4只,取心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、肌肉、脑组织并制备成匀浆液,通过ELISA检测TPKH灌胃后各组织中KGF、HIF-1α蛋白以及TPIN灌胃后各组织中HGF(NK4为HGF的拮抗剂)、IL-2蛋白的表达水平。(4)TPKH及TPIN大鼠长期毒性实验。对照组用0.5mL10%NaHCO3灌胃,实验组不同剂量(1.0×107、1.0×1010cfu/0.5mL·只)TPKH或TPIN灌胃,每周灌胃2次,连续灌胃7周。分别于末次灌胃后的第1天、4周、8周、12周、16周各取大鼠4只进行血常规、血清生化指标、凝血四项、脏器指数的检测,并取末次灌胃后第12周对照组和高剂量灌胃组(1.0×1010cfu/0.5mL·只)大鼠心、肝、脾、肺、肾及胃肠组织,制作病理切片,观察各脏器组织形态,此外,取末次灌胃后的第1天对照组、第1天高剂量组、第4周高剂量组粪便标本进行16s rRNA测序。(5)TPKH及TPIN小鼠细胞免疫实验,对照组用0.1mL10%NaHCO3灌胃,实验组分别用1.0×109cfu/0.1mL·只TPKH或TPIN灌胃,每周灌胃2次,灌胃4周,于末次灌胃后1周,收集全血,用流式细胞仪检测抗凝全血中CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T水平;肠黏膜免疫实验中,对照组用0.1mL10%NaHCO3灌胃,实验组用1.0×109cfu/0.1mL·只TPKH或TPIN灌胃,共灌胃2次,间隔7天,于第二次灌胃后第14天取小鼠12只,取小肠派伊尔结(PP结)和肠系膜淋巴结,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测B细胞活化转录因子(GATA3、PAX5)的表达情况,第28天取小鼠12只,取小肠黏膜,用ELISA检测小肠黏膜中IgA表达量。结果(1)急性毒性实验期间各组小鼠精神状态良好,体重差异不显著(P>0.05),各组小鼠的血常规、肝功肾功指标及脏器指数差异均不显著(P>0.05);病理切片结果显示,高剂量组的心脏、肝脏等脏器组织均无病理性改变。(2)一般药理学实验结果显示,各剂量组TPKH或TPIN对小鼠一般行为均无明显影响,对小鼠自发活动、协调运动无明显影响(P>0.05)。(3)基因表达蛋白分布实验中,ELISA结果显示,与对照组相比,TPKH在灌胃后12、24、48、72、96小时,KGF、HIF-1ɑ蛋白在胃肠组织中能够显著表达(P<0.05或P<0.01),TPIN在灌胃后12、24、48、72、96小时,HGF、IL-2蛋白在胃肠组织中能够显著表达(P<0.05或P<0.01),而在心脏、肝脏等其他组织中各目的蛋白的表达与对照组相比差异不显著(P>0.05)。(4)长期毒性实验中,末次灌胃后的观察期内,各组大鼠均无明显的中毒反应及死亡情况;各剂量组大鼠体重均正常增长,与对照组相比差异不显著(P>0.05);各剂量组血常规、凝血四项、脏器指数与对照组相比,差异均不显著(P>0.05),血清生化指标除末次灌胃后的第1天ALP检测值与对照组比较有差异(P<0.05或P<0.01)外,其余检测指标各剂量组与对照组相比,差异均不显著(P>0.05);末次灌胃后第12周病理切片结果显示,与对照组相比,高剂量组心脏、肝脏等脏器组织均无明显的病理性改变;还发现TPKH灌胃后,能提高肠道益生菌的丰度,对肠道菌群产生有利的影响,TPIN灌胃后,对肠道菌群有一定的影响,但随着时间延长,影响均逐渐减弱。(5)细胞免疫实验中,流式细胞仪检测结果显示,与对照组相比,TPKH、TPIN灌胃组均可促进CD3+T、CD3+CD4+T细胞的活化增殖(P<0.05或P<0.01),提高CD3+CD4+/CD3+CD8+比值(P<0.05);肠黏膜免疫实验中,qRT-PCR结果显示TPKH或TPIN灌胃后均能够促进GATA3及PAX5的表达(P<0.05或P<0.01),ELISA结果显示与对照组相比,TPKH、TPIN灌胃组小肠黏膜IgA表达量显著增加(P<0.01)。结论(1)初步观察到TPKH及TPIN在动物实验中是安全的,未发现有明显毒性作用。(2)TPKH及TPIN能够促进小鼠细胞免疫,还可以增强小鼠的小肠黏膜免疫。