肿瘤疫苗是利用肿瘤抗原激发机体产生特异性的免疫应答，以达到治疗肿瘤或预防肿瘤复发的作用。靶抗原及其免疫方式(载体)的选择是肿瘤疫苗所涉及的两个关键因素。自Gailani等报道非滋养层肿瘤细胞异位表达人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin, hCG)以来，肿瘤细胞表达的异位hCG(ectopice hCG，ehCG)与肿瘤发生、发展的关系受到人们关注。根据文献报道及我们前期的研究结果证实，许多不同类别和组织来源的肿瘤细胞都能不同程度地表达ehCG。多数学者认为，对于非妊娠机体，只有当细胞发生恶性转化时，静息胚胎基因才被激活而表达ehCG。肿瘤细胞自分泌的ehCG具有生长因子活性，能促进和调控肿瘤细胞的增殖、分化和生长，使肿瘤细胞在其微环境中能自我生长；膜结合型ehCG使肿瘤细胞表面呈负电荷，推测可能与肿瘤的转移特性、免疫耐受等有一定的关系，因而，以ehCG为靶抗原的肿瘤疫苗已成为肿瘤生物治疗新的研究热点。Moulto等曾用ehCG蛋白疫苗诱导机体产生了特异性体液免疫应答，但由于蛋白免疫未诱生高水平的特异性细胞免疫应答，因而其抗瘤效果有待提高。基因免疫(genetic immunization)是将含抗原编码基因的真核表达载体直接注入机体，利用宿主细胞表达相应抗原，从而诱导机体产生特异性免疫应答。与传统蛋白疫苗相比，基因免疫不仅能诱导特异性体液免疫应答，而且可诱导特异性细胞免疫应答；载体DNA中含有由CpG基序组成的免疫刺激序列(ISS)，可发挥重要的佐剂作用，有助打破一些自身抗原的免疫耐受，国内外在以原癌基因HER-2/neu为靶抗原的基因疫苗研究中已取得了一定的进展。因此，基因疫苗在肿瘤免疫方面有潜在的应用价值。基于上述分析，本课题以ehCG及相关肽为靶抗原设计肿瘤基因疫苗，通过基因免疫手段免疫小鼠以诱导特异性免疫应答及抗瘤效应，为肿瘤生物治疗寻找新的途径。第一部分 ehCG与肿瘤关系的研究 为探讨ehCG与肿瘤的关系以及进一步论证ehCG作为肿瘤疫苗靶抗原的可行性，我们收集了肿瘤病人血清标本、肿瘤组织病理切片以及肿瘤传代细胞株，并检测其ehCG的表达。结果发现：在60例肿瘤病人血清标本中，有17例为ehCG阳性(总阳性率为28.33%)，其中乳腺癌3例(25.00%，3/12)、卵巢癌6例(50.00%，<WP=6>6/12)、肠癌2例(16.67%，2/12)、宫颈癌1例(8.33%，1/12)以及肝癌6例(41.67%，5/12)；FACS检测结果显示：10株肿瘤细胞不同程度表达ehCG(膜结合型)。在23例大肠腺癌组织标本中，有7例为ehCG阳性(阳性率为30.43%)，免疫组化结果显示：ehCG阳性细胞绝大多数为低分化的癌细胞，同时发现，这些ehCG阳性、分化较差的癌细胞大多位于癌组织向间质浸润的前沿部位、癌组织血管壁附着的癌细胞大多是ehCG阳性。提示：肿瘤细胞表达的ehCG既有分泌型、也有膜结合型；肿瘤细胞表达ehCG可能与肿瘤的发生、发展以及转移特性等有一定的关系。进一步表明，ehCG是一个较理想的肿瘤生物治疗和研究的靶抗原。第二部分 ehCGβ新型肿瘤基因疫苗的构建及及其诱导的特异性免疫应答一、ehCGβ新型肿瘤基因疫苗的构建及鉴定采用PCR法获得ehCGβ链的编码基因（513bp)，定向克隆入TR421质粒，获得ehCGβ的真核表达载体TR421-ehCGβ重组质粒。DNA序列分析?显示，ehCGβ编码基因的序列与报道序列完全一致、读码框架正确。二、ehCGβ新型肿瘤基因疫苗ehCGβ的表达为观察ehCGβ肿瘤基因疫苗在真核细胞内的表达，用脂质体法将TR421和TR421-ehCGβ质粒转染人肝癌细胞系—7721细胞。放射免疫法检测细胞培养上清发现，转染第1天上清即测得ehCGβ蛋白，第3天达高峰。结果表明重组质粒可在真核细胞中表达hCGβ。以TR421-ehCGβ质粒免疫小鼠，检测血清样本发现，免疫后第1天即有ehCGβ的表达，第2天达表达高峰，至少持续5天以上。免疫后第7天，取局部组织经免疫组化染色显示，注射局部肌肉组织可见有明显的ehCGβ表达产物，而空质粒注射部位观察不到ehCGβ表达。表明TR421-ehCGβ质粒能被小鼠注射局部的细胞摄取，并有效表达靶抗原。三、ehCGβ新型肿瘤基因疫苗诱生的特异性体液免疫应答以TR421和TR421-ehCGβ?免疫BALB/c小鼠，ELISA法检测血清抗hCGβ?IgG抗体，结果发现所有TR421-ehCGβ质粒基因免疫小鼠第1周即出现了特异性抗hCGβIgG抗体，与TR421质粒免疫组比较，两者有显著性差异﹙P<0.01﹚；第3周追加免疫后抗hCGβ?IgG抗体的水平持续增高，上升幅度明显高于初次免疫，并至少持续10周以上。第10周，小鼠血清的抗hCGβ?IgG抗体效价达1:102400。表明ehCGβ肿瘤基因疫苗可诱导产生特异性体液免疫应答。四、ehCGβ＋小鼠肿瘤细胞株的建立及其生物学特性的鉴定<WP=7>为检测免疫小鼠诱导的特异性细胞免疫应答，我们构建了BALB/c小鼠源性的ehCGβ特异性靶细胞。以脂质体转染法将构建的pcDNA3-ehCGβ质粒转染Sp2/0肿瘤细胞，经G418筛选培养获抗性细胞集落。为进一步提高转染细胞ehCGβ的表达水平，采用有限稀释法筛选获得5株单克隆细胞，细胞ELISA法检测发现，5株细胞均不同程度表达ehCGβ，其中1号克隆表达水平最高。流式细胞仪检测显示，1号克隆ehCGβ?