目的 乳腺癌是严重危害女性健康的常见恶性肿瘤之一，有报道乳腺癌已经成为全球女性发病率最高的恶性肿瘤，随着国民经济发展和人民生活水平提高，我国乳腺癌的发病率和死亡率都呈迅猛上升态势，在部分城市已上升为女性恶性肿瘤的第一位。乳腺癌的主要治疗手段包括手术、放疗、化疗和内分泌治疗，这些治疗手段尽管缓解了患者的痛苦，但是其疗效及生存质量仍有待于提高，各国学者也在致力于探寻各种更有效的治疗方法。近年来，肿瘤的基因治疗研究逐渐增多，主要方向在于寻找肿瘤基因治疗的特异性有效靶点，从而抑制肿瘤生长，这为乳腺癌的治疗开辟了一个新天地。 越来越多的研究发现，恶性肿瘤存在异常活化的信号转导子和转录激活子(SignaltransducersandactivatorsoftranscriptionStat)，它们是潜在的细胞内转录因子，如果过度激活及表达可导致细胞内信号的过度放大，很可能抵抗凋亡，发生癌变。尤其是Stat3，它在细胞增殖和分化中起重要作用。在许多血液和组织癌症中，Stat3是持续激活的，Stat3的过表达使目的基因表达失调而使细胞生长失控；持续激活的Stat3上调血管内皮生长因子，诱导肿瘤血管生成，参与肿瘤免疫逃逸，抑制免疫功能。已经证实，Stat3在许多血液和实体瘤中持续激活，包括淋巴瘤、白血病、蕈样肉芽肿、多发性骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、脑瘤、胰腺癌、卵巢癌和胃癌等，因此Stat3可以成为乳腺癌治疗的新靶点。 Stat3是调节肿瘤细胞增殖的关键因子之一，最近分子生物学的研究进展为抑制目的基因表达提供了新的技术，目前已有几种方法用来阻断Stat3，其中包括反义核苷酸、核酸酶、异位表达显性失活突变体、干扰RNA、抑制上游激酶、磷酸酪氨酰缩氨酸和诱骗寡核苷酸。其中，核酸酶是一类特殊的RNA分子，它不但储存遗传信息而且具有催化活性，催化剪切特异目的mRNA而使其降解；小干扰RNA可以与特异mRNA结合，阻断它的翻译而抑制目的基因表达，是一种很有潜力的治疗策略。但是这些RNA分子在体内很快就降解，限制了它们的应用。这样DNA技术的应用在调节体内疾病相关基因的转录中具有重要的治疗潜力。 转录因子诱骗技术是通过应用与靶转录因子具有高亲和性的双链寡聚核酸序列(即decoy-ODN)，竞争性抑制转录因子与调控区域的结合，调控转录来改变下游基因的异常表达，抑制肿瘤恶性增殖。利用decoy-ODN靶向性阻断核转录因子的潜在优势在于①decoy-ODN序列较短，合成较为简便、直接，较易进入胞内。②decoy-ODN具有较高特异性，能够很容易的识别靶蛋白。③避开了对靶基因在转录水平上复杂而又繁琐的探究，却又达到了理想的阻断效果。已有报道Stat3decoy-ODN在体外和动物体内治疗头颈鳞状上皮细胞癌和上皮癌已经显示出其有效性，这提示诱骗策略在乳腺癌基因治疗中的应用潜力。本研究以乳腺癌细胞系为研究对象，通过阳离子聚合物介导的DNA转染技术将Stat3decoy-ODN导入乳腺癌细胞系MDA-MB-231与MCF-7后进行细胞学研究和其作用机制的探索。 方法 1.Western印迹方法检测乳腺癌细胞系MDA-MB-231与MCF-7的Stat3总蛋白表达水平。 2.核酸-蛋白凝胶电泳迟滞实验(EMSA)分析Stat3decoy-ODN与Stat结合能力。 3.用阳离子聚合物介导的方法将ODN转染入乳腺癌细胞系MDA-MB-231与MCF-7后，荧光显微镜下观察FITC标记的Stat3decoy-ODN在MDA-MB-231与MCF-7的定位。 4.流式细胞术检测FITC标记的Stat3decoy-ODN在MDA-MB-231与MCF-7的转染效果。 5.细胞计数法与MTT法分析MDA-MB-231与MCF-7细胞增殖能力。 6.转染Stat3decoy-ODN后，应用流式细胞术分析MDA-MB-231与MCF-7细胞周期。 7.RT-PCR方法分析Stat3decoy-ODN对凋亡相关基因mRNA表达水平的影响。 8.Western印迹方法分析Stat3decoy-ODN对凋亡相关基因蛋白表达水平的影响。 9.FACS检测凋亡相关基因蛋白表达水平 结果 1.Westernblot法检测Stat3总蛋白表达水平 收集对数生长期的MDA-MB-231与MCF-7细胞，提取总蛋白，进行WesternBlot分析发现，这两个细胞系Stat3与Phospho—Stat3(Try-705、Ser-727)的蛋白水平均有较高表达，MDA-MB-231表达水平相对较高。 2.Stat3decoy-ODN与Stat结合能力 EMSA结果显示：32P标记的Stat3decoy-ODN与MDA-MB-231与MCF-7的核蛋白抽提物孵育，在垂直凝胶电泳后扫描发现了寡核苷酸与蛋白的结合带，而32P标记的核苷酸随机序列(Scramble)和MDA-MB-231与MCF-7的核蛋白抽提物孵育后未出现这条结合带。 3.荧光显微镜下观察FITC标记的Stat3decoy-ODN在MDA-MB-231与MCF-7细胞内的定位 MDA-MB-231与MCF-7可发现细胞核被DAPI染为蓝色，大部分绿色荧光FITC标记的decoy-ODN都进入胞浆内，部分细胞核有蓝绿色的叠加，说明也有decoy-ODN进入了细胞核。 4.FITC标记的Stat3decoy-ODN在MDA-MB-231与MCF-7的转染效果的流式分析结果 在流式结果中检测到FL1通道呈现阳性分布，并且其阳性率与Stat3decoy-ODN的浓度成正比。 5.Stat3decoy-ODN对细胞增殖的影响 转染Stat3decoy-ODN后，对MDA-MB-231与MCF-7细胞进行计数，其中Decoy-ODN对细胞生长的抑制作用最为明显，与空白对照组比较有显著性差异，并且随着decoy-ODN转染浓度的升高，细胞增殖速率随之降低；而scramble-ODN与空白对照组细胞比较差异无显著性意义。 6.Stat3decoy-ODN对细胞周期的影响 Stat3decoy-ODN转染MDA-MB-231与MCF-7细胞24后，可见两细胞的G1期细胞比率明显上升，而S期比率明显降低。 7.Stat3decoy-ODN对凋亡相关基因mRNA表达水平的影响 Stat3decoy-ODN转染细胞后Bcl-x1，C-myc，CyclinD1mRNA表达水平显著低于空白对照组细胞，而Scramble-ODN组细胞以上各种基因的mRNA表达水平与对照组细胞相比无明显差异。 8.Stat3decoy-ODN对凋亡相关基因蛋白表达的Western结果 Stat3decoy-ODN转染细胞后Bcl-x1，CyclinD1蛋白表达水平显著低于空白对照组细胞，而Scramble-ODN组细胞以上各种基因的蛋白表达水平与对照组细胞相比无明显差异。 9.Stat3decoy-ODN对凋亡相关基因蛋白表达的流式结果 Stat3decoy-ODN转染细胞后应用流式胞内染色Bcl-2，发现其蛋白表达水平显著低于空白对照组细胞，而Scramble-ODN组细胞无明显差异。 结论 本实验应用Stat3表达阳性的MDA-MB-231与MCF-7细胞作为研究对象，通过核酸-蛋白凝胶电泳迟滞实验(EMSA)证明Stat3decoy-ODN与Stat有较高的结合能力。通过阳离子聚合物介导的DNA转染技术将Stat3decoy-ODN和scrambleODNs核酸对照成功的导入乳腺癌细胞系MDA-MB-231与MCF-7中，检测结果显示，转染Stat3decoy-ODN后MDA-MB-231细胞的增殖活性明显低于scrambleODNS组和空白对照组细胞。进一步研究证明，Stat3decoy-ODN明显降低细胞的S期，提示Stat3decoy-ODN能够抑制乳腺癌细胞系的增殖，促进其凋亡STAT3调控的抗凋亡和细胞周期相关基因蛋白表达水平均在Stat3decoy-ODN组细胞明显低于对照组细胞和Scramble组细胞，这表明了Stat3decoy-ODN并非由于本身的核苷酸毒性影响细胞状态，而是通过靶向性结合Stat3，抑制其下游的靶基因的表达来实现对调亡和周期的调控。 本研究表明，通过干预STAT3于靶基因的结合，可以有效抑制乳腺癌细胞的增殖，有望成为一种基因治疗乳腺癌的途径。