肺癌是严重威胁人类生命与健康的恶性肿瘤,发病率、死亡率均位居第一位。目前治疗肺癌的三大手段仍未能显著降低肺癌的死亡率。分子靶向治疗在临床肿瘤治疗中显示出良好的应用前景,也是目前肿瘤研究的热点。实现分子靶向治疗的前提和关键是获得肿瘤特异表达的功能性靶分子、靶基因。为此,本研究采用功能性膜蛋白组技术分离鉴定肺癌功能性基因,并探讨功能性基因在肺癌发生发展中所起的功能作用,从而为肺癌的靶向治疗提供有价值的分子靶标。本研究依据固定细胞免疫荧光实验结果及已有工作基础的体内治疗实验结果筛选获得了3株抗肺癌功能性单抗24H7、2D7、15A1。活细胞免疫荧光亚细胞结构定位及活细胞流式细胞术双重方法证实3株单抗识别的抗原均分布于细胞膜。进一步临床疾病相关性组织表达谱结果表明,3株单抗的靶抗原是在肺癌及其它常见癌临床患者中较特异地高表达,是新的癌症靶向治疗候选靶标,因此继续研究该3种抗原基因具有潜在的应用价值。为此我们分别优化了提取三株单抗目的抗原的方法,并成功获得相对分子量约高于170KD的高质量24H7靶抗原条带、介于72～95KD的2D7靶抗原条带和分子量约43KD的15A1靶抗原条带,进行MALDI-TOF肽指纹图谱鉴定、Mascot数据库分析成功鉴定获得了该3株单抗的靶抗原基因。由于本研究结果需要申请专利,所以MALDI-TOF肽质量指纹图谱数据、蛋白序列及基因名称暂且不能公布。基于文献调研证实2D7靶抗原基因与细胞增殖相关,且表达分布于细胞膜上,与前期实验结果一致的原因,本研究从中挑选单克隆抗体2D7所识别的抗原基因命名为2D7-Ag作为继续研究对象,对其在肺癌发生发展中所起的功能作用进行初步的探讨和研究。首先证明2D7单抗亲和层析纯化获得的蛋白在免疫印迹实验中不仅能够被2D7单抗识别,还能够被商业化羊抗人2D7-Ag抗体识别,且分子量相同,确定了单抗2D7对应的抗原基因的确是2D7-Ag。为了验证已有工作基础中体内外功能实验结果的准确性及可重复性,利用不同浓度梯度的2D7单抗再次进行了肺癌细胞系体外和体内功能的研究。体外抗体中和2D7-Ag基因表达实验结果显示2D7-Ag基因具有促进肺癌细胞增殖、FN基质粘附的功能,但加抗体组与对照组相比细胞迁移能力增强。体内抗体治疗剂量依赖动物实验研究结果表明单抗2D7中和2D7-Ag在肺癌细胞的表达可显著抑制肺癌移植瘤的生长和瘤重,其高剂量组对移植瘤抑制率达43.2%(P<0.05)、低剂量组对移植瘤抑制率达13.5%,且呈剂量依赖关系,从蛋白水平上证明该基因在体内能促进肺癌的快速生长。总之,以上体内外功能实验证明了抗体中和2D7-Ag基因表达显著抑制肺癌细胞系增殖、肿瘤生长结果与前期筛选功能性单抗实验结果较为一致,并且呈现一定的剂量依赖关系,充分说明2D7单抗是一株功能性单抗,其靶抗原基因2D7-Ag是一个功能性肺癌基因。为了从基因水平进一步证明2D7-Ag表达对肺癌细胞生长的促进作用,采用RNAi干扰技术敲降肺癌细胞2D7-Ag基因的表达,检测基因敲降前后肺癌细胞增殖、粘附及迁移侵袭的变化。结果证明2D7-Ag基因敲降后肺癌细胞的增殖能力降低44.5%以上,肺癌细胞与胞外基质与FN粘附水平减少22.1%,肺癌细胞体外迁移能力下降24.2%,肺癌细胞侵袭能力无显著变化。为了探讨2D7-Ag促进肺癌生长增殖的作用机制,我们测定了2D7-Ag基因敲降后对肺癌细胞凋亡和细胞周期变化的影响。研究结果发现该基因敲降后,肺癌细胞凋亡无显著变化,但发生G2期阻滞、细胞倍增时间延长34.5%,致使增殖减慢。这表明2D7-Ag基因通过影响细胞周期进程,从而促进肺癌细胞在体内外的快速增殖和生长。因此该基因具有作为肺癌靶向治疗的一个新的功能性分子靶标的潜力。