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关于BVDV引起的持续性感染发生的分子机制尚未研究清楚,最关键的是BVDV与宿主细胞之间相互作用关系尚未系统性阐述。大量研究表明,当病毒入侵机体细胞,机体细胞会主动诱发凋亡,或凋亡被诱导,进而导致被感染细胞的死亡以及病毒的清除。本实验室前期的实验中使用solexa高通量测序检测了BVDV感染靶细胞MDBK后的差异表达谱显示:mi R-193a的表达量显著性升高,且通过生物信息学软件分析mi R-193a靶向凋亡通路中的相关基因Bax。所以本研究以mi R-193a为研究对象,探究mi R-193a作用于靶蛋白,影响凋亡和BVDV复制的分子机制,进而为阐述BVDV的持续性感染和BVDV防控新方法奠定理论基础。[目的]探究mi R-193a靶向凋亡通路靶蛋白,进而影响凋亡和BVDV复制的分子机制。[方法](1)依据本实验室前期高通量测序结果,选择了显著性上调表达的mi R-193a进行后续实验;(2)扩增mi R-193a前体及其抑制剂pre-mi R-193a-IN,并克隆至慢病毒pll3.7载体中;包装慢病毒,感染MDBK细胞;利用q RT-PCR检测过表达和抑制mi R-193a的作用效果;(3)转染mi R-193a的模拟物和抑制剂进入MDBK细胞,q RT-PCR检测BVDV的复制水平;(4)使用生物信息软件预测mi R-193a的靶基因,构建pmir GLO-Bax 3’UTR重组荧光载体,与pll3.7-mi R-193载体共转染至MDBK细胞,使用荧光分光光度计验证mi R-193a直接靶向靶基因;(5)过表达和抑制mi R-193a后q RT-PCR检测Bax的转录水平,Western blot检测Bax蛋白表达量并使用流式细胞仪检测凋亡率;(6)利用Methprimer软件于pre-mi R-193a上游设计启动子引物,扩增并克隆至荧光素酶载体p GL3-Basic中,使用荧光分光光度计检测可能的启动子;(7)根据可能的启动子区域设计甲基化检测引物,使用亚硫酸盐修饰处理的BVDV感染和未感染的MDBK细胞全基因组DNA为模板扩增并克隆至T载体中,甲基化测序后分析结果;(8)设计干扰甲基化位点的sh RNA,构建sh RNA-慢病毒重组载体,包装慢病毒并侵染MDBK后提取全基因组,经亚硫酸盐处理后为模板扩增并克隆至T载体,甲基化测序后分析甲基化程度;(9)检测不同的sh RNA-慢病毒处理后,mi R-193a的表达水平。[结果](1)过表达pre-mi R-193a慢病毒处理后能显著性上调mi R-193a的表达;相反,过表达pre-mi R-193a-IN慢病毒处理后能显著性下调mi R-193a的表达;(2)q RT-PCR检测转染mi R-193a模拟物后的BVDV复制水平显著性降低,即过表达mi R-193a能抑制BVDV的复制;(3)双荧光素酶报告系统验证mi R-193a能直接靶向于Bax蛋白,并抑制Bax的表达;(4)流式细胞仪检测结果表明转染pll3.7-pre-mi R-193a的MDBK细胞凋亡率显著性上升;Western blotting检测显示Bax表达下调,即mi R-193a能靶向凋亡相关基因Bax,并促进细胞凋亡;(5)成功构建了p GL3-Basic-gene荧光素酶重组载体,并利用荧光分光光度计验证可能的启动子区域为mi R-193a-P4;(6)利用软件成功分析了甲基化的程度显示:BVDV感染的MDBK细胞内mi R-193a启动子区域的甲基化程度比未感染BVDV的MDBK细胞下调19%,证明BVDV感染导致mi R-193a启动子区域发生去甲基化;(7)甲基化测序检测sh RNA-慢病毒感染的MDBK细胞中mi R-193a启动子区域甲基化程度的结果显示:pll3.7-193a-promoter sh RNA-2慢病毒处理后显著性降低甲基化程度,而且增加了mi R-193a的表达,此段区域最可能为mi R-193a的启动子;(8)荧光定量PCR结果显示pll3.7-193a-promoter sh RNA-2慢病毒处理后mi R-193a表达水平最高。[结论](1)mi R-193a可作用于促凋亡基因Bax诱发细胞凋亡,细胞在凋亡发生时形成凋亡小体,吞噬细胞将凋亡小体吞噬,进而发挥溶酶体的融合和降解作用,最终将BVDV病毒降解并清除,mi R-193a就抑制了BVDV的复制。(2)预测并初步鉴定了mi R-193a的可能的启动子区域为mi R-193a-P4;在BVDV感染后可能导致了mi R-193a启动子区域的去甲基化,从而调控mi R-193a的表达上调;pll3.7-193a-promoter sh RNA-2慢病毒能显著性降低甲基化程度,进而增加mi R-193a的表达,更精确了mi R-193a的可能的启动子区域,为有效调控mi R-193a的表达奠定理论基础。