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梗阻性黄疸( Obstructive jaundice)是胆管癌、胰头癌等胆胰恶性肿瘤最主要的临床表现。近年来随着电子计算机断层扫描(computerized tomography,CT)、核磁共振胆胰管成像(Magnetic resonance cholangiopancreatography,MRCP)、内窥镜逆行胆胰管造影(Endoscopic retrograde cholangiopancreatography,ERCP)、超声内镜(Endoscopic ultrasonography,EUS)等医学影像技术的广泛应用,恶性梗阻性黄疸的定位诊断准确性己取得长足的进步。但是,由于胆管癌、胰头癌肿瘤病灶通常较小,尤其是在疾病早期,术前定性诊断仍较为困难。定性诊断的不确定性一方面会增加治疗方案选择的难度;另一方面也会为医疗纠纷埋下隐患。因此积极寻找灵敏性高、特异性好的恶性梗阻性黄疸的定性诊断方法具有十分重要的临床意义。
表观遗传学( epigenetics)是近年来兴起的遗传学的一门前沿分支学科。表观遗传学与经典的遗传学理论相对,是指在基因DNA序列没有发生改变的情况下,基因的功能发生了可稳定遗传的变化,并最终导致了表型的变化。其包括:DNA甲基化修饰、组蛋白的各种修饰、染色质重塑、非编码RNA、X染色体失活等。越来越多的研究表明表观遗传学在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。
DNA甲基化(DNA methylation)是目前研究得最多的表观遗传学内容,它是指由S-腺苷甲硫氨酸提供一个甲基结合到CpG二核苷酸中的胞嘧啶变成5-甲基胞嘧啶(5-mc)。DNA甲基化大多发生在CpG较密集的CpG岛。DNA甲基化时,染色体高度浓缩,染色体结构不稳,导致抑癌基因和DNA损伤修复基因的失活,从而促进肿瘤的发生发展。目前已有不少研究发现在多种恶性肿瘤中存在抑癌基因甲基化。有研究者报道通过检测外周血、尿液、粪便和痰液中某些基因的甲基化状态可达到早期诊断肿瘤的作用。
P16、APC基因是两个重要的抑癌基因,目前已有研究表明在胆管癌、胰腺癌、十二指肠癌中这两个基因启动子区域存在过度甲基化。本研究拟通过收集恶性梗阻性黄疸患者的新鲜胆汁,提取DNA,利用甲基化特异性PCR,检测P16、APC基因启动子区域的甲基化,结合临床资料分析P16、APC基因甲基化在梗阻性黄疸良恶性鉴别中的价值。
一、方法
收集我院自2008年11月~2009年9月共10个月间以梗阻性黄疸为诊断的就诊病例70例,其中病理学诊断为恶性48例,良性22例。所有胆汁按TIANamp GenomicDNA kit说明书提取DNA,凝胶电泳法观察胆汁DNA的质量,紫外分光光度法检测DNA的OD值、胆汁DNA的浓度。用Millipore公司的CpGenome DNAModification Kit S7820说明书步骤对DNA进行修饰后,甲基化特异性PCR进行扩增,在紫外灯下观察产物条带的位置及其强弱。
二、结果
1、通过利用TIANamp Genomic DNA kit能够提取到纯度较高的DNA,所有的胆汁OD值范围为1.5~1.9之间,所有的胆汁DNA浓度约在50~200μg/ml之间。
2、恶性肿瘤引起的梗阻病例中P16甲基化的占72.9%(35/48)。其中来自胆道系统的占69.4%(25/36),来自胰腺的占87.5%(7/8)。良性疾病引起梗阻的病例中P16甲基化的占9%(2/22),均为胆道系统结石。以病理学诊断为恶性作为诊断的金标准,灵敏度72.9%,特异性为90.9%。P16的甲基化阳性与年龄、性别、胆红素、淋巴结转移无关,与肿瘤大小有密切相关( P=0.002)。
3、恶性肿瘤引起的梗阻中APC基因甲基化的占56.25%(27/48)。其中来自胆道系统的占55.55%(20/36),来自胰腺的占62.5%(5/8),来自十二指肠乳头占50%(2/4)。引起梗阻的良性疾病APC甲基化的占9%(2/22),均为胆道系统结石。以病理学诊断为恶性作为诊断的金标准,灵敏度56.2%.特异性为90.9%。APC的甲基化阳性与年龄、性别、胆红素、淋巴结转移无关,与肿瘤大小有密切相关( P<0.001)。
三、结论
胆汁中P16基因启动子区域的甲基化状态能够有效鉴别梗阻性黄疸的疾病性质,具有灵敏度高,特异性好的优点。胆汁中APC基因启动子区域的甲基化状态鉴别梗阻性黄疸的疾病性质特异性好,但灵敏度较差。P16和APC基因的联合检测启动子区域的甲基化状态能够有效鉴别梗阻性黄疸的疾病性质,具有灵敏度高,特异性好的优点。P16、APC的甲基化阳性与年龄、性别、胆红素、淋巴结转移无关,与肿瘤大小有密切相关。