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背景与目的:我们之前的研究显示,在成年雄性Wistar大鼠短暂全脑缺血(transient global cerebral ischemia,tGCI)10min后,间隔1-2d,给予持续60-120min浓度为8％的低氧,可以减少tGCI后海马CA1区神经元的死亡。其中,间隔1d,120minHPC的保护作用最显著,且至少可维持至缺血再灌注后30d。tGCI后0h,24h及144h,海马CA1区p-Akt和FoxOs表达下降,低氧后处理可使tGCI所致的Akt和FoxOs磷酸化水平增加。加入PI3K的抑制剂LY294002,可使Akt和FoxOs的磷酸化抑制,使大鼠海马CA1区的神经元损伤加重,使低氧后处理的神经保护作用消失。糖原合酶激酶3β(Glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)为PI3K/Akt通路中的重要信号分子,GSK3β的表达既受其上游Akt的调控。GSK3β也通过Wnt信号通路影响其下游分子β-链蛋白(β-catenin)的磷酸化,p-GSK3β可抑制β-catenin的磷酸化,并使β-catenin与GSK3β分离。分离后的β-catenin处于稳定状态并被激活,此时,β-catenin在细胞浆中积聚并转位到核内,进一步影响下游靶基因如Bcl-2家族等的表达。低氧后处理减少大鼠tGCI后海马CA1区迟发性神经元死亡的神经保护机制尚未完全清楚。本研究在已经建立的成年雄性Wistar大鼠tGCI低氧后处理的模型基础上,分别观察大鼠海马CA1区在tGCI和低氧后处理后GSK3β、β-catenin、Bcl-2、Bax的表达变化,旨在探索低氧后处理是否通过抑制GSK3β,活化β-catenin,抑制神经元凋亡,从而对短暂全脑缺血的成年大鼠起神经保护作用。 材料与方法:选取成年雄性Wistar大鼠(体重220-280g)。短暂全脑缺血模型按照改良的Pulsinelli经典四血管阻塞模型进行。低氧后处理的方法是在tGCI后24h,将大鼠放入密闭的防潮箱内,连续通入8%O2+92%N2混合气体2h。运用免疫组化、Western blot等方法检测GSK3β、β-catenin、Bax及Bcl-2在短暂全脑缺血及低氧后处理后海马、皮层和纹状体的表达变化。 结果:(1)免疫组化结果显示:与Sham组相比,单纯低氧0h、24h海马CA1区磷酸化GSK3β的表达变化不明显。在tGCI组,CA1区p-GSK3β免疫阳性细胞在再灌注0h开始明显减少(p<0.05),并维持至再灌注7d,缺血各组间差异无统计学意义;tGCI后给予大鼠低氧后处理,低氧后0h,24h和6d,可见锥体细胞层阳性细胞数较再灌注26h,50h及7d组升高(p<0.05)。Western blot结果显示:tGCI后4h,26h,50h,CA1区p-GSK3β表达量均降低,低于Sham组水平(p<0.05),但tGCI4h,26h和50h各组间差异无统计学意义;给予低氧后处理后0h,24h,p-GSK3β与缺血组再灌注26h,50h相比表达量升高,差异有统计学意义(p<0.05)。海马CA1区GSK3β在各组的表达与Sham组相比,无明显变化(p>0.05)。免疫荧光双标显示:成年大鼠Sham组海马CA1区磷酸化GSK3β与神经元胞浆标记物MAP-2共表达。(2)单纯低氧0h及24h与Sham组比较,p-β-catenin免疫阳性表达无明显变化(p>0.05)。tGCI组再灌注7d,p-β-catenin免疫阳性细胞急剧增多,高于Sham组水平,差异有统计学意义(p<0.05)。tGCI后给予大鼠低氧后处理,低氧后24h、6d与对应时间点的tGCI组比较,p-β-catenin阳性细胞数明显减少(p<0.05)。Western blot结果显示,各组与Sham组相比,海马CA1区β-catenin表达无明显变化(p>0.05)。(3)免疫组化结果显示,Bax免疫阳性细胞数在Sham组、单纯低氧0h、24h组海马轻度增多,与Sham组比较,单纯低氧组及tGCI组再灌注0h、4hBax免疫阳性表达变化不明显(p>0.05)。与Sham组相比,tGCI组在再灌注26h-50hBax免疫反应阳性细胞数明显增多,在再灌注7d达高峰(p<0.05)。tGCI后给予大鼠低氧后处理,Bax免疫阳性细胞数明显减少,低氧后0h、24h、6d与对应时间点的tGCI组比较,差异有统计学意义(p<0.05)。Western blot结果显示海马CA1区Bax的表达量在再灌注26h最高(p<0.05),再灌注50h,Bax的表达量仍维持较高水平,但与再灌注26h相比,差异无统计学意义。给予低氧后处理后,低氧后24h与对应时间点的再灌注50h相比,Bax的表达量降低,差异有统计学意义(p<0.05)。(4)Bcl-2免疫阳性细胞在大鼠海马CA1、CA3、齿状回及皮层分布。免疫组化结果显示,tGCI后给予低氧后处理,Bcl-2免疫阳性细胞明显增多,低氧后6d组Bcl-2免疫阳性细胞数与缺血再灌注7d组及Sham组相比,差异有统计学意义(p<0.05)。 Western blot结果显示,各组与Sham组相比,Bcl-2表达差异无统计学意义(p>0.05)。 结论:GSK3β/β-catenin信号传导通路参与了低氧后处理对大鼠短暂全脑缺血的神经保护机制,低氧后处理可能通过抑制GSK3β,活化β-catenin,减少促凋亡蛋白Bax的表达,增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,进而减少神经细胞的损伤,产生神经保护作用。