论文部分内容阅读
棉花产业在我国国民经济中占有举足轻重的地位。利用杂种优势是大幅度提高棉花产量、改进纤维品质和增强抗逆抗病虫能力最有效的方法之一。然而,棉花是常异花授粉作物,并且受温度或光照影响不育系自交结实,导致杂交种纯度下降,进而影响棉花产量和品质等性状。棉花芽黄突变体幼叶黄化,作为标记性状用于移除不育系及杂交种中混杂的个体,可提高棉花杂交种制种纯度。此外,利用棉花芽黄突变体,可研究叶绿素（Chl）生物合成、叶绿体发育及光合作用机制。因此,解析棉花芽黄突变的遗传基础对棉花杂交种育种具有重要的理论和应用价值。本研究以陆地棉TM-1、中棉所60、中棉所58及其芽黄突变体vsp、v1芽黄突变体及海岛棉海7124为实验材料,基于SNP、SSR和In Del标记,利用F2群体对v1和vsp两个芽黄基因进行了精细定位,并对候选基因进行了克隆和分析,初步明确了v1和vsp芽黄突变的遗传基础。主要研究结果如下:1.陆地棉v1芽黄基因精细定位和候选基因分析（1）v1突变体的真叶芽黄,逐渐变为淡绿色,同时Chl含量增加。以TM-1和v1突变体为亲本构建的F2群体中,叶色性状的遗传分离比例符合3:1,表明v1芽黄性状受一对隐性核基因控制。基于SSR、SNP和In Del标记,利用F2群体（TM-1×v1）,将v1基因定位在物理距离为84.1 kb的候选区间内。（2）依据候选区间内的基因注释,推断编码镁螯合酶Gh CHLI亚基的Gh Chl I基因与芽黄突变相关。BLAST分析表明,在陆地棉基因组中Gh Chl I有2个同源基因,分别为Gh＿A10G0282和Gh＿D10G0283。序列分析表明,Gh Chl I的编码区长1269bp,含3个外显子,与TM-1和中棉所60相比,v1突变体Gh＿D10G0283的第3个外显子上存在1个非同义核苷酸突变（G1082A）,该突变引起Gh CHLI亚基的氨基酸（AA）替换（R361K）。分子进化分析表明,Gh Chl I基因第3个外显子编码的AA序列在不同物种中是高度保守的,完全保守的AA替换常导致叶色变异。沉默TM-1Gh Chl I的植株叶片表现芽黄,且Chl含量显著下降。基于上述结果推测,Gh Chl I基因是调控v1突变体叶片芽黄的关键基因。（3）启动子分析发现,来源于TM-1、中棉所60和v1的Gh＿D10G0283启动子之间无变异位点,v1突变体Gh Chl I同源基因启动子之间存在变异位点。根据Gh Chl I同源基因之间的SNP位点,设计特异引物进行q RT-PCR分析,发现v1突变体Gh Chl I的表达量显著高于中棉所60,但v1突变体和TM-1之间差异不显著。v1突变体12 d叶片中的Gh Chl I同源基因的表达量之间无显著差异,而18 d叶片中Gh＿A10G0282的表达量显著高于Gh＿D10G0283。基于这些结果推测,v1突变体Gh＿D10G0283表达量正常,该基因突变（G1082A）引起芽黄,Gh＿A10G0282表达量的增加可能部分弥补了Gh＿D10G0283的缺陷。2.陆地棉vsp芽黄基因精细定位和候选基因分析（1）以TM-1和vsp突变体为亲本构建的F2群体中,叶色性状的遗传分离比例符合3:1,表明vsp芽黄性状受一对隐性核基因控制。对双亲及100个F2单株进行GBS测序,构建了包含4472个Bin标记的遗传图谱。图距总长5384.33 c M,含26个连锁群,标记间的平均遗传距离约为1.2 c M。利用构建的遗传图谱将vsp基因定位在D04染色体上,位于Bin3262至Bin3268标记之间,物理距离为38.32 Mb。利用重测序技术开发分子标记,将vsp基因限定在23.11 Mb的区间内。利用F2群体（vsp×Hai7124）中的484个芽黄单株将vsp基因定位在为353.7 kb的候选区间内。（2）Sanger测序分析候选区间内的基因变异,结果发现中棉所58的Gh＿D04G1108（Gh PUR4）基因全长4468 bp,含2个长分别为42 bp和4197 bp的外显子和1个长229 bp的内含子;vsp突变体Gh＿D04G1108第2个外显子中有201bp（960-1160）DNA片段的缺失。BLAST分析表明,陆地棉中Gh PUR4基因存在3个同源基因,分别是Gh＿D04G1108、Gh＿A04G0646和Gh＿A06G0069。Gh PUR4蛋白包含1412个AA残基,分子量约为154.15 KD。vsp突变体Gh＿D04G1108基因序列的部分缺失造成Gh PUR4蛋白缺失67个AA残基（244-310）。20个不同物种的PUR4蛋白序列比对发现,67个AA残基中,33个高度保守,13个完全保守。