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研究目的课题组大量研究表明KP-4具有心肌保护能力,我们前期研究也发现KP-4保护心肌缺血,并且发现其促进血管新生。为了进一步提高心肌保护活性,本课题组前期以KP-4为先导化合物合成了一系列衍生物,最终筛选出安全性更高、药效更强的KFH-08,并且发现其心肌保护作用依赖于VEGF信号通路。鉴于VEGF信号通路和血管新生的密切关系,我们猜测KFH-08同样具有促血管新生活性。因此,在本研究中,我们将探究KFH-08的促血管新生活性及分子机制,具体包括:1)探究KFH-08的先导化合物KP-4保护心肌缺血和促进血管新生的能力;2)探究KFH-08促进血管新生的能力;3)探究KFH-08促血管新生的分子机制;4)构建vegfb敲除斑马鱼系来探究KFH-08作用的分子机制。研究内容1.KFH-08的先导化合物KP-4保护心肌缺血并促进血管新生构建大鼠慢性心肌缺血模型,给予KP-4处理4周后,对心脏位置进行超声和血流动力学分析来评估KP-4心肌缺血保护作用;同时,使用免疫组化法和小动物活体成像系统（μCT）对KP-4处理后的冠脉血管密度进行评价,发现KP-4可能具有促血管新生活性;最后通过体内外模型验证了这一猜想。2.KFH-08促进血管新生在体外,使用Tg[flk:EGFP]转基因斑马鱼胚胎原代细胞培养技术;在体内,使用VRI抑制Tg[flk:EGFP]转基因斑马鱼血管新生模型,评估KFH-08体内外的促血管新生活性。最后使用Tg[flk:EGFP]/Tg[gatal:d Red]双转基因斑马鱼模型评价新生成血管的功能。3.KFH-08激活与血管新生、MAPK、NOTCH相关基因和线粒体基因的表达使用Tg[flk:EGFP]转基因斑马鱼系,构建VRI抑制斑马鱼血管新生模型,使用RNA seq检测所有基因的表达水平,探究KFH-08促血管新生可能的分子机制。进一步通过RT-q PCR法检测VEGF信号通路相关基因的表达水平。4.CRISPR/Cas9构建vegfb敲除斑马鱼系和心血管发育的初探使用CRISPR/Cas9技术敲除Tg[flk:EGFP]转基因斑马鱼的vegfb基因,对子代斑马鱼进行三代基因测序和筛选,获得敲除vegfb的纯合子斑马鱼(vegfb-/-),初步探究敲除vegfb对斑马鱼心血管发育的影响。研究结果1、在大鼠慢性心肌缺血模型中,KFH-08的先导化合物KP-4显著提高射血分数（EF）、左室收缩分数（FS）、心脏收缩指数（CI）、左室内压上升最大速率（Max dp/dt）和左室收缩压（LVSP）,明显改善心脏的收缩功能,具有心肌缺血保护能力。意外的是,KP-4显著增加心肌细胞毛细血管密度和心脏冠状动脉血管数量,可能具有促进血管新生的能力。进一步通过体内外实验证明了这一猜想,在体外,KP-4促进人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖,增加HUVEC分叉数量和长度;在体内,提高斑马鱼体节间血管出芽率、血管数量和长度。2、KFH-08显著促进血管内皮细胞分化和增殖,明显促进VRI抑制后的斑马鱼体节间血管和头部血管的恢复。进一步对新生成血管的功能性进行研究,发现恢复的体节间血管中有血流流过,血管功能正常。因此,KFH-08具有明显的促血管新生活性。3、使用RNA seq探究KFH-08促血管新生可能的分子机制,发现KFH-08激活了与血管新生、MAPK、NOTCH相关基因和线粒体基因的表达。进一步通过RT-q PCR法发现KFH-08显著提高VEGFA、VEGFB和VEGFR1基因表达量。4、使用CRISPR/Cas9成功构建能够稳定遗传的vegfb敲除的斑马鱼系,初步研究发现敲除vegfb导致斑马鱼胚胎血管损伤和心脏心包膜水肿,影响心血管发育。结论1、KFH-08的先导化合物KP-4保护大鼠心肌缺血并促进血管新生;2、KFH-08具有更强的促进血管新生活性;3、KFH-08促血管新生活性可能与VEGFA、VEGFB和VEGFR1有关;4、成功构建稳定遗传的vegfb敲除斑马鱼系,并发现敲除vegfb导致斑马鱼胚胎血管损伤和心包膜水肿。