心肌梗死是人类的头号杀手,目前通过溶栓或者经皮冠状动脉支架置入术(PCI)等方法快速有效的恢复冠脉血流是减轻心肌损伤的最佳策略。然而,这种心肌再灌注自身亦可以引起心肌损伤,可能导致了最终梗死面积的50 %,这种损伤被称为心肌再灌注损伤。心肌再灌注损伤是一种多种分子和信号转导通路参与,损伤机制与保护机制相互竞争的复杂过程。因此,找到导致或者抑制心肌缺血/再灌注损伤的重要分子能够帮助我们在基础研究或者临床应用中最大程度的利用心肌再灌注的有益作用。本研究选择两个在心肌中也大量表达,但在心肌中功能尚不清楚的两个分子(Homer 1a蛋白和QKI蛋白),试图探明其在心肌再灌注损伤中的表达变化及意义。研究一、Homer 1脚架蛋白Homer在脑、心脏和骨骼肌,肾脏等组织表达。已有研究主要集中于神经系统,所有Homer蛋白都通过其N -末端EVH1域与其他含有脯氨酸富集的基序(PPxxFr)的分子相互作用。所有长Homer亚型可以通过C -末端循环域含有亮氨酸拉链基序与同族或其他Homer家庭成员形成同源、异源二聚体。由于其独特的二聚性能,长型的Homer作为支架蛋白调节多种信号通路;与此相反,短型的Homer,如Homer1a,缺乏二聚体形成结构域,常抑制长型行使的功能。神经系统的研究表明,ERK的激活依赖于Homer 1b/c,而Homer1a可以干扰ERK激活。ERK在心肌中可以抑制心肌细胞凋亡,在再灌注过程中发挥一种心肌保护效应。本研究试图观察Homer 1各亚型在心肌缺血/再灌注中的表达模式,探明其对缺血再灌注所致心肌细胞凋亡的影响及其可能的机制。主要结果如下:1.离体和在体实验都证明缺血/再灌注可以诱导Homer1a上调我们采用商业抗体检测了新生大鼠心肌细胞、H9C2细胞中Homer 1各亚型的表达情况。神经系统中,Homer 1a只有在神经元活动或者受到刺激时才表达。而在我们的观察中,正常心肌细胞可以表达Homer 1a和1b/c,与神经系统略有不同。在培养的新生大鼠心肌细胞和胚心来源的成肌细胞H9C2细胞中采用培养基和氧气同时撤除的方式模拟细胞缺血,Homer 1a都被缺血/再灌注大量诱导表达。与Homer 1a不同,Homer 1b/c在以上处理中均保持稳定。2.沉默Homer 1a增加H9C2的凋亡敏感性为了评价Homer 1a在缺血/再灌注条件下上调的意义,我们设计了针对Homer 1a的siRNA以敲除Homer 1a的表达。敲除之后的细胞再给予9 hr缺血和6 hr再灌注处理,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。转染了阴性对照RNA的细胞凋亡率为43.6±3.4 %,而转染了siRNA的细胞凋亡率为21.2±3.3 %,显著低于ncRNA组(P<0.05)。这些数据提示IR时Homer 1a的上调促进了心肌细胞凋亡。3.过表达Homer 1a增加乳鼠心肌细胞凋亡易感性为了确认Homer 1a是否促进心肌细胞凋亡,我们构建了表达Homer 1a的腺病毒。采用对照病毒(Ad-RFP)或者Homer 1a病毒(Ad-H1a)感染心肌细胞,然后再给予4 hr缺血和6 hr再灌注处理,采用Annexin V单染,流式细胞仪检测凋亡率,未经处理的细胞由于对胰酶的敏感,也产生了3.8±0.8 %的凋亡;感染Ad-RFP的细胞受到上述I4R6处理之后凋亡率为31.7±4.5 %;而感染Ad-Homer的细胞经I4R6处理之后凋亡率为52.8±2.3 %,显著高于Ad-RFP组。4.沉默Homer 1a增加H9C2细胞中IR诱导的ERK1/2激活ERK1/2是一种具有心肌保护作用的激酶,过表达组成性活化的MEK1/2(ERK1/2上游激酶)可以缩小IR引起的心肌梗死范围。沉默Homer 1a之后,4 hr缺血加6小时再灌注都不能诱导Homer 1a增高。4 hr缺血和20 min再灌注之后,ERK1/2被激活,而在Homer 1a沉默的细胞中,ERK1/2激活的程度更加显著。5.过表达Homer 1a抑制IR过程中ERK1/2的激活为了检验Homer 1a对心肌中ERK1/2的激活是否有抑制作用,腺病毒感染乳鼠心肌细胞后给予4 hr缺血加20 min再灌注。我们发现,IR在对照病毒感染的细胞中诱导了ERK1/2的显著激活;而采用腺病毒感染过表达Homer 1a不仅可以抑制ERK1/2的本底磷酸化水平,还可以抑制IR诱导的ERK1/2激活。总之,以上研究首次发现IR可以诱导Homer 1a表达上调,这种上调促进心肌细胞凋亡,可能的机制为Homer 1a的上调抑制了心肌保护激酶ERK1/2的充分激活。研究二、QKI蛋白QKI属于信号转导和RNA激活(STAR)家族蛋白,包括QKI-5、-6、-7三种异构体,qkI的初始转录本C末端外显子选择性剪接后表达。每一种QKI异构体都含有KH RNA结合结构域。QKI蛋白在脑和心脏大量表达并通过调节mRNA代谢发挥作用。QKI在神经系统中的作用得到了广泛的研究,证明其可以通过调控参与髓鞘生成过程中相关mRNA的稳态而参与髓鞘生成,QKI缺乏可以导致髓鞘生成障碍。由于QKI蛋白通过特异结合其靶mRNA的3’UTR起作用,通过生物信息学分析,有很多mRNA可能是QKI蛋白的靶分子,其中促凋亡蛋白Foxo 1 mRNA的3’UTR有3个QKI保守结合位点。因此我们致力于研究QKI蛋白在心肌细胞凋亡中的作用,并试图探明其与FOXO1之间的调控关系。主要结果如下:1.缺血/再灌注抑制QKI-5表达我们采用一个能够检测所有QKI亚型的抗体检测了乳鼠心肌细胞、H9C2细胞和成年大鼠心肌中的QKI表达。采用western blotting方法检测到了40 kDa和38 kDa两条带,按照分子量这两条带应该是QKI5和QKI6。另外采用间接免疫荧光方法检测了QKI的亚细胞定位,发现心肌细胞中QKI主要表达于细胞核,在胞浆中也可淡染。已有证据表明QKI5存在于细胞核,QKI6存在于胞浆和胞核,QKI7只存在于胞浆,故以上的数据提示心肌细胞中主要表达QKI5和QKI6。在NCM和H9C2细胞中,单纯培养基撤除可以抑制QKI5的表达,彻底缺血(培养基和氧供都撤除)进一步抑制QKI5表达,而缺血再灌注可以将QKI5的表达几乎清除。这些现象在免疫荧光实验中也得到了证实。与之不同的是,QKI6在这些处理中都没有发生明显改变。整体动物缺血/再灌注模型中,QKI5和QKI6都发生了表达下降,可能是由于心肌组织中细胞成分过多的原因。2.沉默QKI表达增加H9C2细胞凋亡易感性为了评价IR条件下QKI表达下降的意义,我们在H9C2细胞中采用RNA干涉沉默QKI表达。然后转染了阴性对照RNA(ncRNA)或者siRNA的细胞再用9 hr缺血加6小时再灌注处理。阴性对照未经任何处理,凋亡率为1.8±0.6;感染ncRNA细胞凋亡率为33.2±2.4 %,QKI干涉后细胞凋亡率为54.9±3.5 %,显著高于ncRNA组(P<0.01,图2.2.2)。3.过表达QKI5或者QKI6抑制IR诱导的心肌细胞凋亡乳鼠心肌细胞感染对照或者QKI5、6病毒,然后给与4 hr缺血加6 hr再灌注处理,采用Annexin V和PI双染经流式细胞仪检测凋亡率。4.9±1.6%的细胞凋亡;Ad-CMV组细胞凋亡率为34.0±2.3 %,Ad-QKI6组为14.7±2.2 %,另外,PARP实验还证实Ad-QKI5组凋亡显著低于Ad-EGFP组。4.沉默QKI增加IR条件下FOXO1的表达在不给予IR处理时,FOXO1表达量很低,沉默IR并没有影响FOXO1的表达,可见QKI的降低不是FOXO1升高的诱导因素。ncRNA组细胞中,IR可以使FOXO1表达显著升高;而在siRNA组细胞中,IR诱导的FOXO1增高更加显著。因此我们推测,IR过程中的其他因素诱导了FOXO1的表达,而QKI的降低导致了FOXO1表达的失控。为了证明QKI对FOXO具有负性调控作用,我们做了以下实验。5.过表达QKI5或者QKI6下调FOXO1表达水平,并促其出核在正常情况下,FOXO1表达水平很低,过表达QKI并没有影响其表达。IR诱导FOXO1大量表达,而过表达QKI5或者QKI6之后,将FOXO1的表达抑制到本底水平。间接免疫荧光实验也表明,QKI5或者QKI6过表达能够将细胞核中的FOXO1表达抑制到原始水平。胞浆中仍然能够观察到FOXO1表达,与未处理时水平相近。总之,本研究首次提供证据证明QKI5和QKI6蛋白具有很强的抗缺血、再灌注所致心肌细胞凋亡的作用,这种作用可能通过抑制促凋亡转录因子FOXO1产生。另外,本研究还提示,在模拟缺血/再灌注时QKI5的降低导致了对促凋亡转录因子FOXO1的表达失去控制,最终(至少是部分)导致细胞凋亡的发生。