果实成熟是一个复杂的发育过程，涉及到基因表达和细胞代谢的改变。成熟导致果实呼吸作用上升、乙烯合成增加、色泽转变、风味形成以及软化。成熟过程可以受到许多因素的调节，如发育时期、环境信号以及内源激素等。有关成熟相关基因的分离及其表达调控的研究不仅对阐明果实成熟的分子生物学机制具有重要的理论意义，而且也为实践中人为控制果实的成熟进程提供可靠的理论依据。目前，DDRT-PCR（差异显示反转录聚合酶链式反应）技术已成为克隆差异表达基因的有效手段之一，其在生物学领域中应用的广泛性不断扩大。本实验探讨DDRT-PCR技术研究柿果实成熟差异表达基因的可行性，并以期获悉有关柿果实成熟的可能的分子生物学机制。 柿（Diospyros kaki L.f）营养丰富，并且具有药用保健功效，柿对乙烯敏感，采后易软化，不适于长途运输销售。目前，柿采后生理学研究报道较多，但对柿成熟的分子生物学研究报道还很少。 本研究成功地从富含多糖、多酚的柿果实组织中提取到具转录活性的总RNA，首次采用DDRT-PCR技术对柿果实成熟过程中差异表达的基因进行了研究，实验采用测序胶电泳银染色方法分离差异片段，采用反向Northern杂交法鉴定真实差异片段，实验最终鉴定得到了15条真实差异片段，对测序结果的同源性分析表明，编号为T4的差异片段与公认的GTP结合蛋白基因家族成员具有高度的序列同源性。由此推测，柿果实的成熟启动很可能是通过加强乙烯的信号转导途径而实现的，由此进一步调节成熟相关基因的表达。对本研究取得的结果概括如下： 1．采集不同成熟期柿树果实（品种为硙壳郎，kekelang），进行果实硬度和乙烯释放量的测定．果实硬度测定采用GY-1型果实硬度计；乙烯测定采用抽气取气、气相色谱法。结果表明，伴随果实成熟其硬度迅速降低，在果实转黄时硬度已降到2.0kg·cm^-2以下；乙烯释放先呈缓慢上升的趋势，在果实完全软化变红后出现乙烯释放高峰，峰值过后乙烯释放速率迅速回落。 2．通过吸光比值分析和非变性凝胶电泳实验比较了TRIzoL法、Tris-硼酸法、异硫氰酸胍法、市售经典总RNA抽提试剂盒、Flash UNIQ-10柱离心总RNA抽提试剂盒以及改进的CTAB法提取柿果实组织总RNA的可行性，结果表明：改进的CTAB法获得的总RNA纯度高，完整性好，其吸光比值A260／A230在1.5～2.0之间，A260／A280在1.7～1.9之间；其它方法 柿果实成熟期间差异表达基因的研究 获得的总RNA吸光比值A26mA230均小于o．4，A26WA280多小于1．5， 说明产物中不同程度的含有多糖、多酚及蛋白质的污染。3．利用 DDRTPCR技术，对硬度（kg·cm”2）为 9石的绿色柿果和硬度为 5．3 的黄绿色柿果进行了基因表达差异性的研究。实验分别以硬度为9石 和5．3 的柿果实组织总RNA为模板，利用四种OligO（dT）12MN简并引 物作为锚定引物，先反转录出cDNA的第一链，随即将锚定引物和26种 随机弓I物配成104种弓I物对，利用其进一步对反转录产物实行PCR扩增， 最后通过变性聚丙烯酞胺凝胶电泳显示扩增结果，实验通过筛选分离出 差异表达的片段共66条，其中46条来自子黄绿色柿果，20条来自于绿 色柿果。4．分别以 66条差异片段为模板，在各自第一次PCR扩增相同的条件下进行 ＝次PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳显示扩增结果，采用 Concert Rapid Gel Extraction System对扩增产物实行纯化回收。66条差异片段中有6条没 能获得扩增产物，纯化回收后得到60个差异片段，二次PCR扩增效率为 引％．5．分别将60条纯It回收的差异片段与pMD181载体进行连接，获得的重 组子进一步对感受态大肠杆菌 DHS a菌株进行转化，通过菌落的蓝白鉴 定筛选，最终共获得转化菌落49个．6．对筛选得到的49个白色克隆进行质粒的快速提取，琼脂糖凝胶电泳检测 提取结果，进一步采用 UNIQ—10＃离心式质粒小量抽提试剂盒从48个 含有质粒条带的克隆中纯化质粒。以同位素标记的mRNA反转录产物 cDNA作为探针，对纯化质粒进行反向 Northern杂交，结果共获得 18个 真实差异片段。在这 18个真实差异片段中，5个来自子硬度（kg·。m刁） 为9石的绿色果实，门个来自于硬度为5．3 的黄绿色果实。对15个有效 测序结果分析表明：编号为T4的差异片段与公认的GTP结合蛋白基因 家族的成员具有很高的序列同源性。