在哺乳动物细胞内存在两种形式的胞质精氨酰-tRNA 合成酶 ArgRS一种参与氨基酰-tRNA 合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase, aaRS)复合物的形成另外一种以游离形式存在 相比游离形式的 ArgRS 命名为 ?NArgRS 参与复合物形成的 ArgRS 命名为 cArgRS 在其 N 端多出了 72 个氨基酸的延伸肽段 我们对人胞质 ArgRS 的 cDNA 进行了分析 发现在其编码的开放阅读框Open reading frame, ORF 里也存在对应 ?NArgRS 和 cArgRS 的两个起始密码子 AUG 我们在大肠杆菌中表达了人胞质 ArgRS 并制备抗人 ArgRS 的抗体 采用抗体我们在人细胞内也检测到了两种形式的 ArgRS 经过分析 发现编码人胞质 ArgRS 的 mRNA 的 5’非翻译区存在着一个上游起始密码子upstream AUG, μAUG 从这个 μAUG 开始编码一个短的 ORF 这个 ORF 正好错开了对应 cArgRS 的起始密码子 我们证实从这两个在同一开放阅读框内的起始密码子起始翻译可以得到两种形式的 ArgRS, 并且由于上游起始密码子的存在 促进了编码 ?NArgRS基因的表达 研究了精氨酸类似物刀豆氨酸 L-canavanine 对大肠杆菌 酿酒酵母和人ArgRS 的抑制动力学 测定了抑制常数 刀豆氨酸对这三种 ArgRS 的抑制常数分别为 15μM, 90μM 和 1.5mM 在酿酒酵母 ArgRS晶体结构的基础上构建了 -1-<WP=10>中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士论文 郑勇刚 摘要人 ArgRS的三级结构模型 三级结构模型分析支持大肠杆菌 ArgRS的精氨酸结合位点与人以及酵母 ArgRS的精氨酸结合位点存在着差异 这种结构差异导致了刀豆氨酸抑制效果的差别 刀豆氨酸有可能被进一步开发为更专一的细菌ArgRS 的抑制剂 在第一类 a 亚类(Ia 类)的氨基酰-tRNA合成酶(aaRS)中 超耐热菌 Aquifexaeolicus 亮氨酰-tRNA 合成酶是至今发现的唯一由两个不同亚基组成的双亚基酶,该酶定义为αβ-LeuRS 已知它的β-亚基为 tRNA结合亚基 为了研究该亚基的功能 我们构建了一个酵母三杂交系统 在该系统内β-亚基专一识别对应的亮氨酸 tRNA tRNALeu利用该三杂交系统 从一个β-亚基基因的随机突变库中 筛到了 7 个 tRNALeu结合能力受损的β-亚基突变体 其中两个突变点位于Ia 类 aaRS 特有的α-螺旋束结构域上 可能与其他 Ia 类 aaRS 的该结构域一样参与 tRNA D-茎环的识别 其余的 5 个突变位于亮氨酰-tRNA合成酶 LeuRS 特有的 C-端结构域上 尽管嗜热菌 T. Thermophilius LeuRS的晶体结构已经解出 但是 C-端的这个结构域的晶体结构不清楚 它的高级结构还是未知的 纯化这些β-亚基突变体 通过它们和α-亚基基因的共表达 也纯化得到了αβ-LeuRS 突变酶 研究了β-亚基和相应的αβ-LeuRS 突变体结合 tRNA 能力 测定了它们催化 tRNALeu亮氨酰化动力学性质 发现这些突变均影响了蛋白质在基态下的 tRNA结合能力 此外 发现在β-亚基的 C-端缺失 21个氨基酸的一个突变体影响了 αβ-LeuRS 亮氨酰化反应的过渡态 研究结果表明酵母三杂交这种遗传学筛选方法具有广泛的应用价值 并对研究 aaRS与 tRNA的相互识别和相互作用是一种新的工具 -2-<WP=11>中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士论文 郑勇刚 摘要 我们通过酵母三杂交筛选鉴定出一系列 A. aeolicus αβ-LeuRS ? 的β-亚基的突变 其中只有一个单点突变 N152A 影响了αβ-LeuRS 氨基酰化反应的过渡态 三级结构分析表明这个残基 N152 位于α-螺旋束结构域第二和第三股螺旋的转折处 与 KMSKS 结构域上的一个位于 环区的不变残基 P77 可以形成由水分子介导的氢键相互作用 将 P77 突变后同样影响了氨基酰化反应的过渡态 而且双突变与单点突变表现出一致的氨基酰化动力学性质 表明这两个残基是共同参与作用的 这两个突变不影响酶催化小螺旋的能力 但是影响酶对一个由小螺旋和 D-茎环组成的小底物 tRNALeu? ACVL的催化能力 表明这两个残基参与对 tRNALeu 的 D-茎环的识别 模型分析表明这两个残基可能识别了tRNALeu 个性元件 U8:A14 序列同源性和三级结构分析表明 只有 LeuRS 和CysRS 的这个区域存在不变残基 而且这两者对应的 tRNA 均以三级结构的相互作用作为个性元件 因此位于这两个结构域交界处的不变残基可能共同作用参与作为个性元件的 tRNA三级结构的识别 用体外转录的方法获得了含硫代磷酸酯键的超耐热菌 Aquifex aeolicustRNALeuGAG 转录本 采用基于碘剪切的硫代磷酸酯键的 RNA 足迹 RNAfootprinting 方法研究 tRNALeu 与 A. aeolicus αβ-LeuRS 相互作用 结果表明双亚基 αβ-LeuRS 主要保护了 tRNA 的 D-茎和反密码茎 通过建立的三级结构模型并结合我们以前的研究结果分析发现 αβ-LeuRS 的 α-螺旋束结构域和特有的C-端结构域可能参与保护这些位点 构建并得到了两个高分泌表达来源于假单孢菌 Pseudomonas sp. 130 的戊二酰 -7- 氨 基 头 孢 烷 酸 酰 化 酶 GL-7-ACA 酰 化 酶基 因 的 工 程 菌 株BL21(DE3)/pETCA1S