一、研究背景脓毒症是由严重的感染、烧伤、创伤、休克、外科大手术等引发的一种全身性炎症反应综合症,也是诱发多器官功能衰竭(multiple organ system failure, MOSF)、脓毒症休克最重要的原因。虽然抗生素的广泛应用大幅度降低了脓毒症的死亡率,但近30年,脓毒症的发病率和因脓毒症死亡病例的绝对数字仍呈明显的上升趋势,脓毒症仍然是ICU病人死亡的主要原因。据报道,全球范围内脓毒症的病死率约为20%,即每天约有1400人死于脓毒症。我国危重病患者脓毒症发病率约为15.7%,病死率更是高达30.6%。因此,脓毒症已成为继心血管疾病、癌症之后威胁人类健康的第三位疾病。为此,危重医学界共同呼吁采取措施降低脓毒症的病死率。研究表明,高迁移率族蛋白(high mobility group box 1, HMGB1; high mobility group protein 1, HMG-1; amphoterin)在脓毒症的致死过程中发挥着关键性炎性因子作用。内毒素(lipopolysaccharide, LPS)攻击后8-12小时RAW264.7细胞开始释放HMGB1,释放时间至少可持续72小时。而肿瘤坏死因子诱导的HMGB1释放可持续达96小时,甚至更长。坏死的组织细胞,甚至凋亡细胞也可将内含的HMGB1释放至细胞外。HMGB1一旦进入组织间隙,即可表现出其炎症因子的作用。HMGB1可通过自身毒性作用、刺激其他促炎因子释放、导致凝血、纤溶系统功能紊乱、破坏血管内皮细胞的完整性、扰乱免疫系统功能、破坏肠黏膜屏障的完整性等多种途径参与或加重脓毒症的致病过程。研究表明,即使在致病因素作用后24小时使用抗HMGB1抗体、HMGB1的A盒或丙酮酸等针对HMGB1进行处理,均可显著提高脓毒症动物的生存率。正是由于HMGB1延迟合成与分泌的特点及其广泛的致病作用,HMGB1被认为是脓毒症致病的关键性因子,并可能为脓毒症的治疗带来新的突破。已有的研究显示,利多卡因可作用于炎症反应的多个方面,对炎症过程发挥调节作用。特别是其对免疫功能调节作用的存在,吸引研究者在多种疾病及其模型上对利多卡因的治疗作用进行试验性研究,并取得较好的治疗效果。利多卡因凝胶可使溃疡性直结肠炎患者临床症状明显改善,肠道组织学改变亦有显著的减轻。利多卡因膀胱冲洗可显著改善间质性膀胱炎患者膀胱间质的水肿,促进膀胱壁溃疡的愈合,改善临床症状。利多卡因还可显著降低烧伤病人血清炎性因子的水平,同时病人疼痛程度也明显减轻。在心、肝、肾缺血再灌注损伤、高氧或内毒素肺损伤研究中也有类似的发现。在LPS诱导的脓毒症模型中,提前1小时开始连续3小时的利多卡因静脉输注可显著降低动物病死率。另一项CLP小鼠脓毒症模研究中,预先使用微量渗透泵连续皮下输注利多卡因也有类似的结果。多数报道认为,利多卡因的抗炎作用与其下调NF-κB,抑制TNF-α, IL-1β等早期炎症因子有关。但是,利多卡因抗炎/抗脓毒症作用与]HMGB1的关系尚明确。RAW264.7细胞是小鼠单核巨噬细胞株。研究发现,LPS或IFN-γ刺激下RAW264.7细胞分泌HMGB1的水平与人外周血单核细胞相似。因此,本研究我们首先以RAW264.7细胞为研究对象,在细胞水平观察利多卡因对LPS诱导的RAW264.7细胞HMGB1释放的影响。然后,以Wistar大鼠为研究对照,使用盲肠结扎穿孔的方法制作脓毒症动物模型,并将不同剂量的利多卡因(5,10,20mg/kg)在CLP后0,1,2小时腹腔内注射,观察利多卡因对脓毒症大鼠肝、肾组织内HMGB1表达的影响,进一步在动物整体水平探讨利多卡因抗炎/抗脓毒症的机制。最后直接采用纯化重组HMGB1制作动物模型,观察利多卡因在整体动物水平和器官水平对HMGB1直接致损动物的保护作用。二、方法1、细胞实验：RAW264.7细胞以5×106个/ml的密度种植在96孔组织培养板中。取生长状态良好的细胞,分为5组,每组5孔。具体操作：除去含FBS的RPMI 1640培养液,无血清RPMI 1640培养液洗涤3遍,(1)阴性对照组(C组)仅加入无血清的RPMI 1640培养液1ml；(2)阳性对照组(LPS组)加入内含100ng/ml LPS的无血清的RPMI-1640培养液1ml；(3)利多卡因1组加入内含2μg/ml利多卡因和100ng/ml LPS复合液1ml；(4)利多卡因2组加入内含20μg/ml利多卡因+100ng/ml LPS复合液1ml；(5)利多卡因3组加入内含200μg/ml利多卡因+100ng/ml LPS复合液1ml。5组细胞均于孵育箱中培养24h后收取培养上清和细胞。ELISA测定上清液HMGB1水平,PCR测定细胞内HMGB1 mRNA表达,ActiveMotif NF-κB家族试剂盒测定NF-κB。2、动物实验：2%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔内注射麻醉动物。假手术组(Sham组,n=15)打开腹腔后缝合,其他各组制作盲肠结扎穿孔(CLP)脓毒症模型。术后0、1、2小时Sham组和生理盐水处理组(NS组,n=20)分别腹腔内注射生理盐水0.5ml,利多卡因各组(n=15)分别注射利多卡因5、10和20mg/kg(用生理盐水稀释至0.5m1)。24小时后过量麻醉剂处死动物,留取血液和器官标本。实时PCR测定器官HMGB1 mRNA表达,免疫组化检测定器官NF-κB p65,光学多显微镜检查组织病理变化,全自动生化分析仪测定血浆ALT、Cr, ELISA测定肺MPO和小肠MDO。另取100只动物分4组进行7天生存率观察,制作Kaplan-Meier生存率曲线,Log-rank法进行生存率比较。3:HMGB1直接损伤实验C3H/HeJ小鼠30只,分3组(n=10)：对照组(C组)、HMGB1组(H组)和利多卡因组(L组)。2%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔内注射麻醉动物。C组腹腔注射生理盐水1ml；H组,腹腔内注射高纯度人工重组HMGB1 (rHMBG-1) 500μg/lml; L组接受H处理后0、1、2小时腹腔内利多卡因20mg/kg(用生理盐水稀释至0.5ml)。进行生存率观察。另取C3H/HeJ小鼠30只,分3组(n=10)：对照组(C组)、HMGB1组(H组)和利多卡因组(L组)。2%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔内注射麻醉动物。C组气管内注射生理盐水501μl；H组气管内注射rHMBG-1100μg/50μl;L组接受H处理后0、1、2小时腹腔内利多卡因20mg/kg。观察气管灌洗液中性粒细胞比和蛋白含量、肺湿干重比、肺组织MPO活性、肺组织TNF-a水平、NF-κB蛋白含量和肺病理改变。4：统计学处理：组间比较使用多参数单因素方差分析(Holm-Sidak method)检验。生存率比较Log-rank检验进行。数据使用SPSS17.0统计软件包或SigmaPlot11.0处理并作图。P<0.05,认为差别有统计学意义。三、结果1、细胞实验：ELISA显示,利多卡因处理可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞HMGB1的释放,且呈明显剂量依赖性。与LPS组(3.18±0.527ng/ml)比较,利多卡因20.200μg/ml组上清液HMGB1水平(1.81±0.391 ng/ml,1.66±0.238 ng/ml)明显降低(t=4.640；t=5.148,P<0.001)。免疫细胞化学显示,正常培养组RAW264.7细胞胞浆内没有HMGB1特异性染色或淡染；LPS刺激可使巨噬细胞体积增大,伪足伸出,部分细胞胞核染色变蓝,胞浆HMGB1特异性染色加深；利多卡因组细胞体积和形态改变不明显,部分细胞HMGB1的释放被抑制,胞浆内HMGB1特异性染色浅。PCR观察到利多卡因抑制细胞内HMGB1mRNA表达,与LPS组(44.44±5.82ng/ml)比较,利多卡因20μg/ml组(27.91±6.88ng/ml)、利多卡因200μg/ml组(19.34±2.71ng/ml)组HMGB1 mRNA表达水平均显著降低(t=4.489,P=0.001；t=5.784,P<0.01)。同时,利多卡因处理也可显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NF-κB活性增强(P<0.05)。2、动物实验：1)提高动物生存率：CLP术后12小时开始部分动物活动减少,不能自洁；嗜睡,对外界环境改变失去兴趣；竖毛；饮水减少。随着的时间的延长,动物出现呼吸急促、腹泻；甚至仰卧；死亡。表现脓毒症模型复制成功。CLP术后第5天生理盐水组(NS)脓毒症大鼠全部死亡(n=25),利多卡因5、10、20mg/kg处理组术后第7天仍有部分动物存活。Log-rank分析显示,利多卡因5,10,20mg/kg组大鼠生存率与生理盐水组间比较存在统计学意义的差异(X2=5.472,P=0.19；X2=12.859,P<0.001：X2=26.237,P<0.001)。X22)改善器官功能：CLP各组术后24小时ALT水平较假手术组(41.60±7.89U/1))升高(P<0.05)。利多卡因10、20mg/kg处理组(71.20±8.76 U/1,58.00±10.37U/1)与NS组(92.00±13.38 U/1)存在统计学意义上的差异(t=3.162,P=0.005；t=5.168；P<0.001)。CLP各组术后24小时血Cr水平较假手术组(20.40±5.32μmol/l))升高(P<0.05)。利多卡因5、10、20mg/kg处理组(44.80±3.7μmol/l, 34.80±4.44μmol/l,27.40±2.30μmol/l)大鼠术后24小时血Cr水平较生理盐水组(51.00±5.00μmol/l)降低,且差异有统计学意义(t=2.285,P=0.033；t=5.971,P<0.001；t=8.699,P<0.001)。CLP各组术后24小时肺组织MPO活性较假手术组(4.602±0.719)升高(P<0.05)。利多卡因10、20mg/kg处理组(6.854±0.248,6.327±0.321)与NS组(8.945±0.317)存在统计学意义上的差异(t=8.099,P<0.001；t=10.143,P<0.001)。CLP各组术后24小时回肠组织DAO水平较假手术组(0.849±0.113)降低(P<0.05)。利多卡因10、20mg/kg处理组(0.418±0.066,0.521±0.048)与NS组(0.192±0.052)存在统计学意义上的差异(t=5.136,P<0.001：t=7.466,P<0.001)。3)减轻组织病理损伤：CLP 24小时肝、肾、肺和小肠出现广泛的组织学损伤和炎症细胞浸润,利多卡因(20mg/kg)处理可明显减轻组织学损伤和炎症细胞浸润。4)抑制器官HMGB1过表达和NF-κB活化；实时PCR和免疫组化显示,利多卡因可剂量依赖性的抑制CLP诱导的肝、肾、肺和小肠组织HMGB1mRNA的过表达和NF-κB的活化。3:HMGB1直接损伤实验rHMBG1 500μg腹腔内注射2小时内动物出现明显的内毒素血症样表现,48小时动物80%死亡,利多卡因处理组死亡率为20%。Log-rank分析显示,利多卡因处理可显著提高大鼠生存率(X2=4.736,P=0.03)。在rHMBG1 100μg急性肺损伤实验观察到：与对照组比较,HMGB1组、利多卡因组支气管灌洗液中性粒细胞比和蛋白含量显著增加,肺组织湿干重比、肺髓过氧化物酶活性、NF-κB和TNF-a蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)；与HMGB1组比较,利多卡因处理组上述指标均明显降低(P<0.05)。四、结论利多卡因抗炎/抗脓毒症作用可能与其抑制LPS诱导的巨噬细胞HMGB1 mRNA合成、转位与释放,调节NF-κB活化有关；利多卡因腹腔内注射可抑制CLP脓毒症大鼠组织HMGB1的过表达,保护肝、肾功能,提高生存率；利多卡因腹腔内注射可降低致死剂量HMGB1的毒性反应,保护器官功能；利多卡因抑制HMGB1的表达及其毒性损伤作用可能与下调NF-κB炎症通道有关。