Neddylation修饰是一种类泛素化修饰方式,其与泛素化修饰类似能够靶向于其特异性的底物并对底物蛋白进行一系列修饰。Neddylation修饰是在三种酶的参与下,将神经前体细胞表达的发育下调蛋白8(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 8,NEDD8)泛素样蛋白分子转移至特异性底物上进行修饰并对靶蛋白生物学功能进行调控。NEDD8-Activating Enzyme(NAE)是活化NEDD8的唯一激活酶,若其被抑制剂抑制,将完全阻断整个Neddylation进程,导致肿瘤细胞死亡。MLN4924是针对NAE的特异性的抑制剂,目前处于临床试验阶段,其对多种肿瘤有较好的疗效,但在一些癌细胞中NAE发生突变,使癌细胞对MLN4924产生耐受性。为了解决NAE突变使癌细胞产生耐受的问题,开发针对NAE-Ubiquitin Conjugating Enzyme E2 F(UBE2F)相互作用的抑制剂筛选方法具有较高应用价值。本文主要针对NAE-UBE2F相互作用的抑制剂筛选方法进行构建,首先对NAE、UBE2F和NEDD8原核表达载体的构建,分别将NAE、UBE2F和NEDD8的目的基因克隆入pET28b、pGEX-6p-1和pCOLADuet-1中。并成功运用原核系统蛋白表达纯化技术将重组蛋白表达分离纯化出来,在体外评价了三种重组蛋白的活性。而后利用HTRF技术对三种重组蛋白进行酶浓度及反应条件的探索,并利用阳性化合物MLN4924对HTRF筛选方法进行评价,最终成功构建关于NAE-UBE2F相互作用的抑制剂筛选方法。酶水平的活性筛选,我们发现抗真菌类化合物Micafungin Sodium和Caspofugin Acetate的IC50分别是21.08±1.695μM和16.25±1.655 μM。运用蛋白热稳定实验验证了化合物能够与UBE2F靶向结合,此化合物在细胞水平和分子水平上抑制NAE和UBE2F之间的相互作用。细胞水平上分子机制的研究发现,Micafungin Sodium和Caspofungin Acetate对细胞的增殖活力影响较小,但可导致Neddylation下游靶蛋白的积累,在某种程度上能够抑制胃癌细胞的转移能力和克隆形成能力。