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目的:HPV16中的E6/E7蛋白是肿瘤发生发展中的主要致癌基因,且E6/E7的长期持续感染可导致肺癌发生。已有研究发现,E6蛋白主要通过降解p53基因来抑制细胞凋亡,E7蛋白主要通过抑制视网膜母细胞瘤蛋白（p Rb）来促进细胞增殖。因此,由E6和E7蛋白调控的信号通路在肿瘤发生过程中可能并不完全相同,然而两者在肿瘤调控机制中的区别却很少有报道。肝激酶B1（LKB1）是一种抑癌基因,是体内多种肿瘤发生的关键屏障,控制着肿瘤的发生、分化及转移。我们的前期研究发现,E6和E7蛋白均可下调肺癌细胞中LKB1的表达,但E6和E7蛋白调控LKB1分子机制的区别并不清楚。Wong等研究发现,驱动蛋白家族成员7（KIF7）在前列腺癌中具有抑癌作用,并可以通过诱导LKB1在ser428位点的磷酸化,上调p-LKB1（ser428）的表达,促进LKB1的抗肿瘤活性。然而,KIF7在HPV相关肺癌中是否能调控LKB1、以及活化的p-LKB1（ser428）的亚细胞定位并不清楚。Cui等研究证明,miR-106a在宫颈癌中具有致癌作用,HPV16 E7可上调其表达进而抑制LKB1的表达,促进宫颈癌细胞增殖,而E6对miR-106a无调控作用。但E6和E7与miR-106a在HPV相关肺癌中是否存在调控关系尚不明确。因此,研究HPV相关肺癌中E6/E7与KIF7和LKB1之间的调控关系、E6/E7与miR-106a和LKB1之间的调控关系、p-LKB1（ser428）的亚细胞定位情况是本课题的几个主要目标,旨在为HPV相关肺癌的靶向治疗提供新的治疗靶点及研究方向。研究方法:1.应用质粒转染和干扰序列转染技术双向调控肺癌细胞中E6、E7的表达,应用蛋白质免疫印迹（Western Blot）方法检测KIF7、LKB1和p-LKB1（ser428）表达水平,定量反转录-聚合酶链反应（q RT-PCR）方法检测miR-106a、KIF7和LKB1的m RNA表达水平;2.双向调控肺癌细胞中KIF7、miR-106a的表达,应用Western Blot检测LKB1和p-LKB1（ser428）表达水平,应用q RT-PCR检测LKB1的m RNA表达水平;3.双向调控肺癌细胞中KIF7、miR-106a的表达,采用核浆分离技术提取细胞浆和细胞核蛋白,通过Western Blot检测胞浆及胞核中LKB1和p-LKB1（ser428）表达水平,探讨活化的p-LKB1（ser428）的亚细胞定位情况,明确LKB1抗肿瘤活性的决定因素。4.应用CCK8实验及克隆形成实验评估KIF7、miR-106a对肺癌细胞增殖的影响,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。5.采用SPSS22.0软件对本研究数据进行处理,以P<0.05表示结果有统计学意义。结果:1.筛选肺癌细胞系。结合我们前期的研究,HPV16 E6和E7蛋白在H1299细胞系中表达较低,在A549细胞系中表达较高。在此结果的基础上,我们选择H1299细胞系分别转染p EGFP-N1-HPV16 E6和p EGFP-N1-HPV16 E7质粒,而在A549细胞系中分别转染si E6和si E7干扰细胞内源性E6和E7的表达。利用Western Blot实验检测KIF7蛋白在正常人支气管上皮细胞（HBE）及3种肺癌细胞系（H460、A549、H1299）中的表达情况,RT-PCR实验检测miR-106a在正常人支气管上皮细胞（HBE）及3种肺癌细胞系（H460、A549、H1299）中的表达情况。结果显示,KIF7在3种肺癌细胞系中蛋白表达量均低于HBE细胞。在H1299细胞系表达量较高,而在A549和H460中较低。miR-106a在2种肺癌细胞系（H1299、A549）中表达量均高于HBE细胞,在H1299细胞系表达量较高,A549细胞系较较低,在H460细胞系中表达量低于HBE细胞。基于上述结果,我们选择A549细胞系转染p EF6/V5-His-KIF7质粒,选择H1299细胞系转染si RNA干扰其内源性KIF7的表达;选择A549细胞系转染miR-106a的模拟物,选择H1299细胞系转染miR-106a的抑制物。2.HPV16 E6/E7上调miR-106a的表达,下调LKB1、p-LKB1（ser428）的表达;E6下调KIF7蛋白的表达,E7对KIF7表达无调控作用。将p EGFP-N1-E6和p EGFP-N1-E7质粒分别转入低表达E6/E7的H1299细胞系中,对照组为模拟转染和E6/E7空载体。结果显示,过表达E6/E7,miR-106a表达水平显著上调,p-LKB1（ser428）表达水平显著下调,LKB1蛋白及m RNA水平显著下调。过表达E6,KIF7蛋白水平显著下调,m RNA水平基本不变;过表达E7,KIF7蛋白及m RNA表达水平均不变。3.敲除E6/E7下调miR-106a的表达,上调LKB1、p-LKB1（ser428）的表达;敲除E6上调KIF7蛋白的表达,敲除E7对KIF7表达无调控作用。为了进一步验证E6/E7对miR-106a、KIF7、LKB1和p-LKB1（ser428）的调控作用,将E6/E7特异性si RNA转入高表达E6/E7的A549细胞系中,对照组为E6/E7非特异性si RNA和模拟特异性si RNA。结果显示,干扰E6/E7,miR-106a表达水平显著下调,p-LKB1（ser428）表达水平显著上调,LKB1蛋白及m RNA水平显著上调。干扰E6,KIF7蛋白水平显著上调,m RNA水平基本不变;干扰E7,KIF7蛋白及m RNA表达水平均不变。4.KIF7抑制肺癌细胞增殖,促进肺癌细胞凋亡。向低表达KIF7的A549细胞系中转染p EF6/V5-His-KIF7质粒,以p EF6/V5-His空载体和模拟转染为对照组;向高表达KIF7的H1299细胞中转染KIF7特异性si RNA,以KIF7非特异性si RNA和模拟特异性si RNA为对照组。应用CCK-8实验、细胞克隆形成实验及流式细胞仪进行检测。结果显示,过表达KIF7,A549细胞增殖能力显著减弱;干扰KIF7,H1299细胞增殖能力显著增强,细胞克隆形成能力显著增强,细胞凋亡比例显著减少。5.KIF7上调LKB1和p-LKB1（ser428）的表达。为验证E6调控LKB1是否通过影响KIF7的蛋白表达,KIF7是否能够诱导LKB1磷酸化,我们在低表达KIF7的A549细胞系中瞬时转入p EF6/V5-His-KIF7质粒,对照组为p EF6/V5-His空载体和模拟转染。结果显示,过表达KIF7,LKB1蛋白和m RNA表达水平显著上调;p-LKB1（ser428）表达水平显著上调。6.敲除KIF7下调LKB1和p-LKB1（ser428）的表达。将KIF7特异性si RNA转入高表达KIF7的H1299细胞系中,对照组为KIF7非特异性si RNA和模拟特异性si RNA。结果显示,干扰KIF7,LKB1蛋白和m RNA表达水平显著下调;p-LKB1（ser428）表达水平显著下调。7.KIF7上调细胞浆中p-LKB1（ser428）的表达。为验证KIF7对p-LKB1（ser428）亚细胞定位的影响,我们在低表达KIF7的A549细胞系中瞬时转入p EF6/V5-His-KIF7质粒,对照组为p EF6/V5-His空载体和模拟转染。分离细胞浆和细胞核蛋白后,Western Blot实验结果显示,过表达KIF7,细胞浆中p-LKB1（ser428）表达水平显著上调;细胞核中p-LKB1（ser428）表达水平基本不变。8.敲除KIF7下调细胞浆中p-LKB1（ser428）的表达。将KIF7特异性si RNA转入高表达KIF7的H1299细胞系中,对照组为KIF7非特异性si RNA和模拟特异性si RNA。分离细胞浆和细胞核蛋白后,Western Blot实验结果显示,干扰KIF7,细胞浆中p-LKB1（ser428）表达水平显著下调;细胞核中p-LKB1（ser428）表达水平基本不变。9.miR-106a促进肺癌细胞增殖,抑制肺癌细胞凋亡。向低表达miR-106a的A549细胞系中转染miR-106a模拟物,以miRNA-mimics和模拟转染物作为对照组;向高表达miR-106a的H1299细胞中转染miR-106a抑制物,以miRNA-inhibit和模拟抑制物作为对照组。应用CCK-8实验、细胞克隆形成实验及流式细胞仪进行检测。结果显示,转染miR-106a模拟物,A549细胞增殖能力显著增强;转染miR-106a抑制物,H1299细胞增殖能力显著减弱,细胞克隆形成能力显著减弱,细胞凋亡比例显著增加。10.miR-106a下调LKB1和p-LKB1（ser428）的表达。将miR-106a模拟物转染到低表达miR-106a的A549细胞中,对照组为miRNA-mimics和模拟转染物。结果显示,过表达miR-106a,LKB1蛋白和m RNA表达水平显著下调;p-LKB1（ser428）表达水平显著下调。11.敲除miR-106a上调LKB1和p-LKB1（ser428）的表达。将miR-106a抑制物转染到高表达miR-106a的H1299细胞中,对照组为miRNA-inhibit和模拟抑制物。结果显示,干扰miR-106a,LKB1蛋白和m RNA表达水平显著上调;p-LKB1（ser428）表达水平显著上调。12.miR-106a下调细胞浆及细胞核中p-LKB1（ser428）的表达。为验证miR-106a对p-LKB1（ser428）亚细胞定位的影响,我们将miR-106a模拟物转染到低表达miR-106a的A549细胞中,对照组为miRNA-mimics和模拟转染物。分离细胞浆和细胞核蛋白后,Western Blot实验结果显示,miR-106a的过表达显著下调了细胞浆和细胞核中p-LKB1（ser428）的表达水平。13.敲除miR-106a上调细胞浆及细胞核中p-LKB1（ser428）的表达。将miR-106a抑制物转染到高表达miR-106a的H1299细胞中,对照组为miRNA-inhibit和模拟抑制物。分离细胞浆和细胞核蛋白后,Western Blot实验结果显示,干扰miR-106a的表达显著上调了细胞浆及细胞核中p-LKB1（ser428）的表达水平。结论:1.HPV16中的E6蛋白通过下调KIF7蛋白表达进而抑制肺癌细胞中LKB1的抗肿瘤活性,而E6蛋白对KIF7 m RNA表达无调控作用。2.HPV16中的E7蛋白虽然也能抑制LKB1的抗肿瘤活性,但并不是调控KIF7完成的。3.HPV16中的E6和E7蛋白均可通过上调miR-106a的表达进而抑制肺癌细胞中LKB1的抗肿瘤活性,与文献报道宫颈癌中E6蛋白对miR-106a没有调控作用的结论不一致。4.过表达或干扰KIF7,均可调控细胞浆中p-LKB1（ser428）表达水平,细胞核中p-LKB1（ser428）表达水平没有变化。5.LKB1的抗肿瘤活性是由两个因素决定,一个是LKB1的磷酸化,另一个是亚细胞定位,即p-LKB1（ser428）必须定位在细胞浆中才能发挥抗肿瘤活性。两者缺一不可。