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鱼腥草注射液是由鱼腥草药材经水蒸汽蒸馏、重蒸馏、吐温80增溶、过滤、分装和灭菌而制成的中药注射液。具有明显的抗菌、抗病毒、增强机体免疫力、抗炎、抗过敏、镇咳、降糖等作用,临床用于治疗呼吸道感染、病毒性肠炎、湿疹、恶性肿瘤。但从1988年至2006年期间,有关鱼腥草类的注射液严重不良反应报告已有222例,SFDA于2006年发布关于暂停使用和审批鱼腥草注射液等7个注射剂的通告[33]。由此说明,目前中药注射液安全性检测方法无法准确、有效地排除含有过敏物质的鱼腥草注射液,无法保障其临床用药安全。为了进一步保障鱼腥草注射液临床用药的安全性,本论文依据鱼腥草注射液不同制备工艺制剂在动物过敏试验和GC/MS、LC/MS化学成分两方面的差异,初步探究鱼腥草注射液的过敏物质,并建立相对安全的鱼腥草注射液的制备工艺,从而提高鱼腥草注射液在临床使用的安全性。具体研究内容如下:(1)、优化了鱼腥草注射液Ⅰ型过敏反应动物模型。通过敏感动物筛选和佐剂增敏试验来优化Ⅰ型过敏反应动物模型。前者筛选了 ICR小鼠、SD大鼠、豚鼠和BN大鼠;后者比较了鱼腥草注射液与注射液加佐剂对BN大鼠的致敏性。研究结果表明,最优的Ⅰ型过敏反应动物模型为:以血浆中IgE、组胺、类胰蛋白酶和β-氨基己糖苷酶为指标,采用卵蛋白为阳性药物,BN大鼠为敏感动物,弗氏佐剂增敏。同时,结果显示:鱼腥草注射液除吐温80外,还存在其它过敏物质。(2)、对鱼腥草注射液类过敏反应动物模型进行了初步研究。以血浆中IgE、组胺、类胰蛋白酶、β-氨基己糖苷酶、C4b和C5b-9的变化率为指标,通过敏感动物筛选试验初步研究了鱼腥草注射液类过敏反应动物模型。试验结果表明:1%的卵蛋白可作为Ⅰ型过敏反应的阳性药物,但不能用于类过敏反应,需增加阳性药物的筛选。从类过敏角度分析,ICR小鼠、SD大鼠、豚鼠和BN大鼠对鱼腥草注射液和吐温80的敏感性低,需扩大动物筛选的范围。(3)、建立了相对安全的鱼腥草注射液的制备工艺。采用优化的过敏模型探讨了鱼腥草挥发油两种萃取工艺的安全性,试验中采用临床使用安全性相对较高的2-羟丙基-β-环糊精为增溶剂,排除了辅料对过敏试验的影响,使试验结果更可靠。结果表明:水蒸汽蒸馏法制备的鱼腥草初馏液中存在能够引起BN大鼠产生Ⅰ型过敏反应的物质,而超临界萃取所得的挥发油中不存在这种物质。从安全性角度分析,鱼腥草挥发油提取工艺中二氧化碳超临界萃取优于水蒸汽蒸馏法。以鱼腥草挥发油萃取率、甲基正壬酮的含量为考察指标,通过单因素试验和正交试验优化了超临界萃取、重蒸馏和增溶工艺。同时,以超滤代替原工艺中的微滤,并采用冷冻干燥的方法将其制成粉针剂,大大提高了注射液的澄明度、稳定性和临床用药的安全性。获得的最佳制备工艺条件为:取鱼腥草,粉碎过2号筛,采用超临界二氧化碳萃取,萃取压力25 Mpa,温度45℃,萃取90 min,得超临界萃取物;然后加入适量的蒸馏水,140 ℃重蒸馏2h,收集0.5L/kg的重蒸馏液;加入7.5g/kg左右的羟丙基-β-环糊精,60℃磁力搅拌3 h;加注射用水定容至0.5 L/kg,用分子量10000的超滤膜进行超滤,分装至西林瓶中,先预冻至-45℃,保持2h,调节真空度至0.1mbar,升华干燥24h,在升温至20℃,干燥6h,灭菌,即得。新的制备工艺较原工艺存在4种差异:(1)、工艺的差异:采用二氧化碳超临界萃取方法提取鱼腥草挥发油,较原工艺中的水蒸汽蒸馏法,不仅提取率高,而且安全性好。(2)、辅料的差异:新工艺中采用2-羟丙基-β-环糊精为增溶剂,代替原工艺中的吐温80,大大提高了临床用药的安全性。(3)、以超滤代替原工艺中的微滤,能有效的去除大分子杂质,不仅提高了注射液的澄明度,还提高了安全性。(4)、剂型的差异:原工艺制备的注射液属于水溶性注射剂,稳定性差;而新工艺中将鱼腥草制成冻干粉针剂以提高注射液的稳定性。以优化的过敏模型探讨了新工艺的安全性。结果表明:鱼腥草冻干粉针剂不能引起BN大鼠产生Ⅰ型过敏反应,即鱼腥草在超临界萃取、重蒸馏、增溶和冷冻干燥的工艺中未生成过敏物质,所得的冻干粉针剂对BN大鼠的致敏性远低于原工艺制备的注射液。(3)、发现了 15个疑似过敏物质并建立了鱼腥草蛋白ELISA检测方法。采用GC/MS和LC/MS分析水蒸汽蒸馏、超临界萃取制备的鱼腥草挥发油的化学成分。从GC/MS图谱分析,2种工艺制备的挥发油中有24个共有峰,主要为萜、醛酮、脂肪醇、低级脂肪酸、酯类等轻质类脂化合物;31个差异峰,其中前者比后者共多出了 17个色谱峰,但相似度在85%以上的只有11个,分别为:2-己烯醛、2,3-二甲基吡啶、苯甲醛、芳樟醇、异龙脑、右旋龙脑、乙酸龙脑酯、葵酰甲酯、月桂醛、2-十三酮和石竹烯氧化物。从LC/MS图谱分析,在正离子模式下,水蒸汽蒸馏比超临界注射液多2个保留时间分别为0.52和20.12 min的色谱峰;在负离子模式下,水蒸汽蒸馏比超临界注射液多2个保留时间分别为21.78和24.36 min的色谱峰。而这11种成分多含有羰基或羟基等活性基团,可能易与血清蛋白中的氨基耦联成为全抗原,从而增加了其对BN大鼠致敏的可能性。根据抗原抗体特异性结合的原理建立了专属性强、灵敏度高的鱼腥草蛋白ELISA检测方法:鱼腥草抗原用包被液按比例稀释,包被在96孔聚乙烯酶标板上,4 ℃湿盒过夜,PBS洗2遍,用2%小牛血清白蛋白溶液(溶剂为PBS溶液,pH 7.4)封闭10 min,加入100μL 1:1000(PBS)稀释的兔抗鱼腥草血清(一抗)孵育2 h,PBS洗5遍,加入100 μL 1:10000(PBS)辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG溶液(二抗)孵育2 h,PBS洗5遍,加100μLOPD/H202底物磷酸缓冲液,最后加100 μL的2 mol/L硫酸终止反应,用酶标仪在490 nm处记录吸收度。线性范围:0.038-3.8 μg/mL,检测限和定量限约为9.88和14 ng/mL。