壬基酚(nonylphenol，NP)是全球商用第二大非离子表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚(nonylphenolethoxyl砒es，APEs)的主要降解产物，广泛地分布于河流和泥沙中。近年来的研究表明壬基酚作为一种重要的环境内分泌干扰物可能对人或野生动物的生殖产生不良影响。特别是已有许多实验证据表明壬基酚对雄性动物生殖系统有特异的毒性：NP可使雄性大鼠睾丸、附睾、前列腺萎缩，曲细精管结构异常；可直接或间接地导致睾丸细胞的凋亡；使精子产量降低。 本实验室以往的研究都提示我们：壬基酚对哺乳动物雄性生殖系统的毒性作用主要源于其促睾丸细胞凋亡的作用。 烷基酚类化合物作为一类疏水性有机物质容易在脂肪组织和生物膜系统中富集。而壬基酚则是一种典型的烷基酚类化合物，它的分子构形可看作由一个亲水头和一条疏水尾组成，与构成生物膜的磷脂分子有一定相似性。因此我们可大胆地假设壬基酚分子可嵌入细胞膜，从而影响膜的通透性、流动性。细胞膜通透性的改变必然会破坏细胞的内环境，并可能影响由细胞膜介导的信号传导功能。本实验的目的是检验壬基酚及烷基酚类化合物对支持细胞细胞膜通透性的影响，并在此基础上探索烷基酚类化合物对支持细胞细胞膜通透性产生影响的构效关系，进而探讨烷基酚类化合物致支持细胞死亡和细胞膜通透性增加这两种作用之间可能存在的关系。 一、目的1.建立一套实用、高产、稳定的哺乳动物睾丸支持细胞培养方法。 2.研究壬基酚对哺乳动物睾丸支持细胞细胞膜通透性的影响。 3.研究烷基酚类化合物的结构与其增加细胞膜通透性作用的关系。 4.研究烷基酚类化合物致支持细胞死亡和细胞膜通透性增加这两种作用之间可能存在的关系。 二、方法1.大鼠睾丸支持细胞的分离、纯化和培养取28天的雄性SD大鼠的睾丸，采用胰蛋白酶和胶原酶分步消化的方法分离得到大鼠睾丸支持细胞和生精细胞的混和物，再利用这两种细胞贴壁能力的差异，去除生精细胞，纯化支持细胞。 2.兔睾丸支持细胞的分离、纯化和培养取35天的雄性新西兰大白兔的睾丸，采用胰蛋白酶和胶原酶分步消化的方法分离得到睾丸支持细胞和生精细胞的混和物，再利用这两种细胞贴壁能力的差异，去除生精细胞，纯化支持细化。 3.多种方法研究壬基酚对哺乳动物睾丸支持细胞细胞膜通透性的影响(1)免疫荧光法检测细胞表面的乳酸脱氢酶(LactateDehydrogenase，LDH)将培养纯化的兔睾丸支持细胞接种于盖玻片上，加入壬基酚，使壬基酚的终浓度分别为0，5×10-8，10-7，2×10-7和4×10-7mol/L。加药24小时后，进行免疫荧光染色。荧光显微镜上观察并拍照。图像软件分析总绿灰度值和平均绿灰度值，由这两种统计值来表示细胞表面FITC的含量，并最终表示细胞表面的LDH的多少。SPSS软件统计。 (2)生化法检测细胞LDH泄漏率将培养纯化的大鼠睾丸支持细胞细胞接种于48孔板，加入壬基酚，使壬基酚的终浓度分别为0，5×10-8，10-7，2×10-7和4×10-7mol/L。分别于加药后的12和24小时测定LDH的泄漏率。吸取培养细胞的上清，于自动生化分析仪上测定LDH的含量(细胞外LDH)。向培养孔中加0.5ml的1％TritonX-100裂解细胞，收集孔中的溶液测定LDH的含量(细胞内LDH的含量)。LDH泄漏率=细胞外LDH/(细胞外LDH+细胞内LDH) (3)用FDA检测细胞膜通透性将培养纯化的大鼠睾丸支持细胞细胞接种于盖玻片上，加入壬基酚，使壬基酚的终浓度分别为0，5×10-8，10-7，2×10-7和4×10-7mol/L。24小时后取出盖玻片放入15μg/ml的FDA溶液中，37℃孵育5分钟。取出盖玻片PBS洗涤2次，荧光显微镜上观察并拍照。将盖玻片放入PBS溶液中，2小时后重新取出盖玻片荧光显微镜上观察并拍照。荧光强度的前后变化可作为检测细胞膜通透性的指标。 (4)用PI检测壬基酚作用后支持细胞的死亡率将培养纯化的大鼠睾丸支持细胞细胞接种于盖玻片上，加入壬基酚，使壬基酚的终浓度分别为0，5×10-8，10-7，2×10-7和4×10-7mol/L。24小时后取出盖玻片放入10μg/ml的PI溶液中，37℃孵育5分钟。取出盖玻片PBS洗涤2次，荧光显微镜上观察并拍照。图像软件分析死亡细胞的个数，SPSS软件统计。 4.烷基酚类化合物的结构与其增加细胞膜通透性作用的关系将培养纯化的大鼠睾丸支持细胞细胞接种于48孔板中，分别加入甲基酚、丁基酚和壬基酚，使药物的终浓度分别为0，5×10-8，10-7，2×10-7和4×10-7mol/L。分别于加药后的12和24小时测定LDH的泄漏率。 三、结果1.经过对传统方法的多次改良，最终建立了一套实用、高产、稳定的大鼠支持细胞培养方法。支持细胞产率达107个/g睾丸组织，纯度达95％以上。 2.兔支持细胞培养产率达2×107个/g睾丸组织，纯度达90％以上。 3.壬基酚作用可增加哺乳动物睾丸支持细胞细胞膜通透性 (1)免疫荧光染色发现，壬基酚作用24小时可使支持细胞表面分泌的LDH增多，当壬基酚浓度为10-7mol/L时，总灰度值显著升高，当壬基酚浓度为2×10-7和4×10-7mol/L时总灰度值比对照组有极显著增加。当壬基酚浓度为10-7和2×10-7mol/L时，平均灰度值显著升高，当浓度为4×10-7mol/L时平均灰度值比对照组有极显著增加。 (2)生化方法检测发现，壬基酚可导致支持细胞LDH泄漏率提高，12小时作用时，壬基酚大于等于10-7mol/L时，LDH泄漏率比对照组有极显著增加，这种作用是呈剂量依赖关系的；24小时作用时，各壬基酚剂量组的LDH泄漏率比对照组都有极显著增加，LDH泄漏率增加达到上限，各组之间没有剂量依赖关系。 (3)用FDA检测细胞膜完整性发现，初始荧光强度各组之间无显著差异。2小时后，各组的剩余荧光强度分别为89.4％、67.8％、50.6％、48.0％和36.7％。其中NP1组比对照组有显著差异，而NP2、NP3、NP4组与对照组有极显著差异，并且剩余荧光强度的降低呈现剂量依赖效应。 (4)PI染色显示壬基酚作用24小时能使死亡细胞数明显增多，当壬基酚浓度为1×10-7mol/L时与对照组相比有显著差异，当浓度为2×10-7和4×10-7mol/L时与对照组相比有极显著差异。 4.三种直链烷基酚都可增加细胞膜通透性，并且这种作用与其结构有一定的关系(1)12小时作用时，丁基酚和壬基酚的作用要强于甲基酚。对于甲基酚，只有最高浓度才有显著作用；而丁基酚和壬基酚则在10-7mol/L就有极显著的作用。直链烷基酚化合物增加细胞膜通透性的作用与其烷基链的长度成正比。 (2)24小时作用时，三种烷基酚的作用是相似的。而且LDH泄漏有一个最大值大约为43％(比对照组高33％)。 四、结论1.壬基酚可增加哺乳动物睾丸支持细胞细胞膜通透性，并且这种作用在短时间内(12小时)呈现剂量依赖效应。 2.壬基酚可促使睾丸支持细胞死亡，并且这种作用与其增加支持细胞细胞膜通透性的作用存在密切关系。 3.三种直链烷基酚(甲基酚、丁基酚和壬基酚)都可增加细胞膜通透性，并且这种作用与其烷基链的长度成正比。 4.建立了实用、高产、稳定的大鼠和兔睾丸支持细胞的原代培养体系，支持细胞产率分别达到107个和2×107个/g睾丸组织，纯度分别达到95％和90％。 五、本研究的特色和创新之处1.建立了一套实用、高产、稳定的哺乳动物睾丸支持细胞培养方法。为今后的研究工作打下了坚实的基础。 2.从一个全新的角度去研究壬基酚对哺乳动物睾丸支持细胞毒性作用的机理，首次研究并发现，壬基酚可增加哺乳动物睾丸支持细胞细胞膜通透性，并且这种作用与壬基酚促使睾丸支持细胞死亡的作用存在密切关系。 3.首次研究并发现，直链烷基酚都可增加细胞膜通透性，并且这种作用与其烷基链的长度成正比。