【摘 要】
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目的:前期临床实验提示L-型钙通道（L-type calcium channels,LTCCs）与高血压和内皮细胞功能异常有关,为此本研究旨在观察LTCCs蛋白各亚基在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）上的表达情况,初步探索其通道激动剂及其主要功能亚基Cav1.3 LTCCsα1亚基的编码基因CACNA1D过表达后对HUVECs炎症反应的影响。方法:1.通过q RT-PCR、核酸电泳实验和免疫荧光染
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目的:前期临床实验提示L-型钙通道（L-type calcium channels,LTCCs）与高血压和内皮细胞功能异常有关,为此本研究旨在观察LTCCs蛋白各亚基在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）上的表达情况,初步探索其通道激动剂及其主要功能亚基Cav1.3 LTCCsα1亚基的编码基因CACNA1D过表达后对HUVECs炎症反应的影响。方法:1.通过q RT-PCR、核酸电泳实验和免疫荧光染色技术研究LTCCS蛋白各亚基在HUVECs上的表达情况;2.激光共聚焦技术动态观察,使用激动剂Bay-k 8644处理HUVECs后胞内钙离子(Ca2+)浓度变化;3.通过q RT-PCR和Western Blot检测激动剂Bay-k 8644对HUVECs黏附分子ICAM-1、VCAM-1的表达变化,及其相关信号分子变化情况。4.通过基因芯片技术,分析Cav1.3编码基因（CACNA1D）过表达后HUVECs的分子表达、疾病相关性和信号通路的差异,初步探讨Cav1.3在内皮细胞炎症反应及其他生理功能中的作用。结果:一、LTCCS在HUVECs中的阳性表达及其离子通道功能:1.q RT-PCR结果表明,HUVECs以Cav1.2和Cav1.3的LTCCsα1亚基m RNA表达量较高,Cav1.1和Cav1.4表达量极低。2.Cacnb1、Cacnb2、Cacnb3和Cacnb4分别编码LTCCSβ2亚基的四种亚型,以及Cacna2d1、Cacna2d2和Cacna2d3分别编码LTCCsα2δ亚基的四种亚型的m RNA也被检测到有阳性表达;3.钙离子荧光实验证实,在加入激动剂后,HUVECs细胞内Ca2+荧光强度出现明显的先增加后减少的动态变化。二、LTCCS参与上调HUVECs黏附分子ICAM-1、VCAM-1及其机制的初步探讨:1.通过q RT-PCR实验摸索出在LTCCS激动剂浓度为20μM时,其ICAM-1（DMSO VS 20μM,P=0.02）、VCAM-1（DMSO VS 20μM,P=0.003）均出现明显上调。2.以20μM为最佳刺激浓度,分别设置不同的刺激时间梯度来研究其具体机制;通过Western Blot实验证实ICAM-1、VCAM-1和NF-κB的表达量及PKC、Erk、IκB磷酸化水平随时间增加而升高（P<0.05）。三、CACNA1D基因过表达后HUVECs分子表达差异研究:1.通过基因芯片技术分析:相对于NC对照组而言CACNA1D过表达后,有上调基因数:213;下调基因数:260;其中VCAM-1、SELE、ICAM-1等黏附分子均呈现上调趋势;2.基于IPA的经典通路分析结果显示,CACNA1D过表达后白细胞渗出相关信号通路被显著激活;3.疾病相关性分析结果表明,CACNA1D与炎症疾病、心血管疾病等密切相关。结论:1.LTCCs在内皮细胞中有阳性表达,α亚基以Cav1.2、Cav1.3表达为主;2.初步验证LTCCS激动可上调内皮细胞ICAM-1、VCAM-1的表达;3.CACNA1D过表达后HUVECs众多黏附分子表达呈现上调趋势,Cav1.3过表达后可能参与内皮细胞的炎症反应过程。
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