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厚叶旋蒴苣苔为我国特有的物种,十分耐旱,具有复苏植物的特点。利用RT-PCR技术克隆了一个干旱胁迫相关的脱水素基因和两个WRKY转录因子基因,并在转基因植物的实验系统中研究其功能。以染色体步行法克隆了脱水素基因的5端调控区,对其的功能和表达调控进行了研究。对WRKY基因的表达特点进行了分析。在此基础上将上述基因用于草坪草高羊茅的改良,取得良好进展。
1.利用RT-PCR方法从厚叶旋蒴苣苔中克隆脱水素类基因(BcDh1)。
从干旱诱导的厚叶旋蒴苣苔叶片分离mRNAs,通过RT-PCR方法扩增得到BcDh1的全长cDNA序列(759bp)。序列分析表明BcDh1为SK2型脱水素类基因。从基因组DNA中克隆DBcDh1的基因。测序结果表明,在保守的S区末端多了一个306bp碱基的内含子。并将二者分别置于植物表达载体中,导入模式植物烟草和矮牵牛中表达。
2.在转基因烟草中研究BcDh1的功能将厚叶旋蒴苣苔的BcDh1基因的全长cDNA及其反义BcDh1序列分别置于花椰菜花叶病毒35S启动子调控之下,导入烟草(W38)。正义基因转化的植株与对照相比,表现出矮化,粗壮;反义基因转化的烟草与对照相比,植物细弱,较高,开花时间滞后;生理指标检测表明,在渐进的水分胁迫下,转基因(BcDh1和DBcDh1)的植株的光合作用强度有所降低,但较对照下降幅度小。相对电导率测定表明转基因植株相对电导率较低,说明转化BcDh1基因的烟草具有一定的干旱耐受特性。将基因组的DBcDh1基因转化的烟草与cDNA克隆的BcDh1的转基因烟草做比较,其中光合作用强度、电导数据表明转DBcDh1基因烟草比转BcDh1基因的烟草对于旱的抗性更强。将转基因烟草的T1代种子置于含PEG8000的MS培养基中萌发,发现DBcDh1转化的烟草比BcDh1基因转化的烟草生长更快。推测内含子在转录调控中有一定的增强作用。
3.BcDh1基因转化的矮牵牛将35S::DBcDh1基因用于转化矮牵牛(Petuniahybrida)。保水力测定表明转基因矮牵牛比未转基因矮牵牛叶片的保水力明显增强,转BcDh1基因的矮牵牛的耐旱能力比未转基因植株有所增强。低温电导率测定实验表明转基因矮牵牛叶片细胞在低温胁迫时,使细胞冰点降低,从而使转基因矮牵牛对低温的耐性比未转基因矮牵牛有明显增强。
4.BcDh1基因导入高羊茅的研究构建了ubiquitin启动子驱动下的BcDh1基因的表达载体,其中具有ubi/bar选择标记基因。利用基因枪法,将该基因导入高羊茅(Festucaarundinacea)草坪草。结果表明:转基因高羊茅在充分供水时的光合速率和水份利用率(光合速率/蒸腾速率)与对照相比无明显差别。当轻度干旱胁追时,转基因高羊茅草坪草的光合速率高于对照,随着胁迫的程度加剧,当重度水分胁迫时,转基因高羊茅仍保持相对高的光合作用和较高的水份利用效率。模拟冻害的低温电导率测定实验表明:转基因高羊茅的耐低温比对照增强-3~-6℃。BcDh1明显提高了高羊茅的耐寒性。
5.脱水素基因(BcDh1)启动子的分离和5端功能分析利用接头介导的PCR技术,从厚叶旋蒴苣苔(B.crassfolia)基因组DNA中,分离出970bp的BcDh1基因的5端调控序列。其中含多个非生物胁迫反应元件:ABA反应元件(ABRE),干旱反应元件(DRE/C-repeat),热击元件(HSE),伤害反应元件(WUN-motif),乙烯反应元件(ERE)和MYB转录因子结合位点(myb-bindingsite,MBS)。为分析该启动子的表达方式提供了资料。将全长BcDh1启动子的和不同缺失的启动子与GUS构建成嵌合基因,用于转化烟草。分别用脱水、冷诱导、盐诱导、热激以及外加ABA、MeJA、JA、SA处理转基因烟草。利用荧光法检测各种处理下GUS的表达量,结果表明全长BcDh2启动子及不同缺失的启动子驱动下的GUS基因都有一定的活性,但对各种处理的反应强度各不相同。启动子中某些区段的存在使转基因植物的GUS活性降低,推测该启动子还存负调控元件。
6.厚叶旋蒴苣苔WRKY基因的分离和特征分析WRKY为植物特有的一类转录因子。近年的研究表明这一超级基因家族参与植物多种生理过程的调控,如病害防御,衰老以及腺毛发育等。有关WRKY转录因子对非生物胁迫下的反应,报道尚少。依据WRKY的W-box的保守序列设计引物,以RT-PCR的方法,克隆了两个新的WRKY基因片段BcWRKY1和BcWRKY2。随后以5RACE的方法得到了BcWRKY2的全长cDNA,序列分析表明BcWRKY2属于Ⅲ型WRKY。对3端非翻译区,进行顺式作用元件分析,表明可能存在转录后调控的方式来控制WRKY转录因子的表达。Northern杂交分析表明:BcWRKY2基因在正常生长的植物体中是不表达的,但在不同的环境胁迫(干旱,低温,盐)和外加诱导物(外源JA,MeJA和SA)的情况下有着不同的表达特征。这一WRKY基因对冷诱导和SA有强烈表达,但对干旱反应不敏感。