研究背景鼓室硬化(Tympanosclerosis)是指中耳在长期慢性炎症愈合后所遗留的中耳结缔组织退行性变,是引起传导性耳聋的重要原因之一。其主要的病理变化为中耳粘膜下层及鼓膜固有层中出现透明变性和钙质沉着。1869年Von Tr(o∣¨)ltsch首次详细描述了鼓室硬化并提出“硬化(sclerosis)”一词。1956年Z(o∣¨)llner进行大量鼓室成形术后,发表“鼓室硬化”(Tympanosclerosis)论文,该病得以正式命名。鼓室硬化的发病率各家报道不一,国外为20%～43%,国内为3.7%～11.7%。随着鼓室成形术广泛开展和手术显微镜普遍使用,本病逐渐被耳科医师所认识,并受到关注。目前,鼓室硬化临床上多采用手术治疗,但是硬化灶往往无法彻底清除,术后形成瘢痕与粘连,影响听力,可见鼓室硬化的治疗比较复杂和困难。手术治疗使患者的精神和身体均受到很大损失,远期效果有待考证,于是我们期待能从病因方面对其进行预防和干预,既减少病人痛苦,又节省医疗资源,符合现代医学要求。多数学者认为临床上慢性化脓性中耳炎和分泌性中耳炎鼓膜切开置管后可引起鼓室硬化发生,但是其具体病因不明,认为其主要病因为慢性化脓性中耳炎、分泌性中耳炎及鼓膜切开置管,另外与中耳创伤、出血、自身免疫、血钙增高等因素有关。从循证医学角度出发,通过建立动物模型,诱导动物发生鼓室硬化来验证慢性化脓性中耳炎和鼓膜切开置管是鼓室硬化的重要病因。本研究选择豚鼠为实验对象,豚鼠中耳解剖结构和人类似,并且耳壳大易操作易观察,另外参考国外文献也多选择豚鼠进行耳科学研究建模。本研究通过构建豚鼠模型来验证慢性化脓性中耳炎和鼓膜切开置管是鼓室硬化的重要病因。通过向鼓室内注射金黄色葡萄球菌及鼓膜切开置管两种方法构建豚鼠鼓室硬化的动物模型。建模成:叻后取中耳粘膜硬化灶,通过与豚鼠正常耳的中耳粘膜进行比较,研究鼓室硬化模型豚鼠中耳粘膜光镜及电镜下的结构特点,明确鼓室硬化的发生过程。目前国内对鼓室硬化病因学研究较少,在这方面有很大研究空间,有重要临床价值。同时,本实验属耳显微外科操作,可以锻炼研究者的手术技能和使用显微镜的技巧,为从事耳显微外科手术打下良好基础。目的从循证医学角度,通过制备豚鼠鼓室硬化的动物模型,验证慢性化脓性中耳炎和鼓膜切开置管是鼓室硬化的重要病因,观察鼓室硬化的发生过程,研究中耳粘膜鼓室硬化的光镜电镜特点。方法1.材料选取健康杂色黑目豚鼠60只,普通级,雌雄不拘,体质量为250～350 g,由南方医科大学珠江医院实验动物中心提供。所选豚鼠均为耳廓反射灵敏,电耳镜检查可见鼓膜完整、光锥清晰,排除外耳道、鼓膜、中耳等感染。2.实验步骤实验分三部分进行:2.1模型一:选择健康杂色豚鼠30只,设为自身对照,左耳为实验组(30耳),右耳为对照组(30耳)。麻醉后在无菌条件下于左耳鼓膜前下象限注射金黄色葡萄球菌液100 ul,制成慢性化脓性中耳炎模型,右耳为正常对照。术后1、3、6个月时分别断头处死动物,观察实验组和对照组鼓膜及中耳粘膜的组织形态变化,观察是否有鼓室硬化发生。2.2模型二:选择健康杂色豚鼠30只,设为自身对照,左耳为实验组(30耳),右耳为对照组(30耳)。麻醉后在无菌条件下于左耳鼓膜前下象限切开置入通气管,右耳为正常对照。术后1、3、6个月时分别断头处死动物,观察实验组和对照组鼓膜及中耳粘膜组织形态变化,观察是否有鼓室硬化发生。2.3取模型一及模型二的实验组的硬化灶和对照组的鼓室粘膜,分别进行光镜及透射电镜标本的制作,并进行观察。2.3.1标本取出后分两组,一组予福尔马林固定,予苏木精-伊红染色后用于光镜下检查。2.3.2另一组取材用于电镜下观察:2.3.2.1取材与固定:先将固定液及所用容器预冷,在1分钟内把组织块切成2×2×1mm大小,先浸入2.5%戊二醛固定液中固定3小时(前固定),再经0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.2)漂洗,再予2%四氧化锇固定2小时(后固定),再经0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.2)漂洗。2.3.2.2梯度脱水:30%酒精脱水8分钟,50%酒精脱水8分钟,70%酒精脱水8分钟,90%酒精脱水12分钟,100%酒精脱水3次,每次12分钟。2.3.2.3浸透、包埋聚合步骤:脱水剂:包埋剂=1:1,1小时;脱水剂:包埋剂=1:2,2小时;纯包埋剂,5小时;标本转入塑料囊,70℃,10小时。Epon812环氧树脂包埋2.3.2.4超薄切片:顶端平面为一规则长方形、正方形或梯形,面积约0.2～0.3mm~2。2.3.2.5染色:予醋酸铀及柠檬酸铅染色,在干净的培养皿内放置蜡板,把醋酸铀染液滴在蜡板上,将捞有切片的铜网覆于染液上30分钟,然后用双蒸水冲洗、吸干。铜网覆于柠檬酸铅染液上10分钟,用双蒸水冲洗、吸干。2.3.2.6电镜下观察结果1.模型一:以鼓膜穿孔、听泡内积脓作为化脓性中耳炎的诊断标准,均观察到造模成功。造模实验组中造模1个月10耳中均未出现鼓室硬化,造模3个月10耳中3耳出现鼓室硬化病理改变,造模6个月10耳中5耳出现鼓室硬化病理改变。对照组30耳中均未出现鼓室硬化病理改变。经统计学分析,实验组(慢性化脓性中耳炎)鼓室硬化的发生率高于对照组鼓室硬化的发生率。在造模3个月及更长时间的实验组中出现鼓室硬化病理改变,组织中钙质沉积及纤维化程度与慢性化脓性中耳炎持续时间呈正相关。2.模型二:实验组中造模1个月的除1耳化脓预剔除实验外,9耳均未出现鼓室硬化,造模3个月的10耳中有3耳出现鼓室硬化,造模6个月的10耳中有4耳出现鼓室硬化。对照组的30耳中均未出现鼓室硬化。经统计学分析,实验组(鼓膜切开置管)鼓室硬化的发生率高于对照组鼓室硬化的发生率。在造模3个月及更长时间的实验组中出现鼓室硬化病理改变,组织中钙质沉积及纤维化程度与慢性化脓性中耳炎持续的时间呈正相关。3.形态学观察结果:手术显微镜下:正常豚鼠鼓膜光滑透亮,鼓室内粘膜薄,光滑,呈淡粉色,听泡骨壁薄而光滑,未见钙化。模型豚鼠粘膜增厚,呈现不同程度纤维化及钙化。光镜下:正常豚鼠鼓室粘膜薄,粘膜层次清楚,细胞结构正常,未见钙化。模型豚鼠粘膜增厚,结构不清,纤维组织增生,部分出现钙化。电镜下:正常豚鼠鼓室粘膜呈现细胞多、胶原纤维少。造模豚鼠胶原纤维增多,纤维细胞伸长退变,溶酶体聚集,内质网扩张成囊状,部分出现纤维细胞胞内或胞外出现钙质沉着。结论1.鼓室硬化的发生是个渐进的过程,向豚鼠鼓室内注射金黄色葡萄球菌导致慢性化脓性中耳炎诱发鼓室硬化的动物模型切实可行。慢性化脓性中耳炎是鼓室硬化的一个重要病因。2.豚鼠鼓膜切开置管的方法可制备鼓室硬化的动物模型。鼓膜切开置管是鼓室硬化的一个重要病因。3.豚鼠中耳粘膜组织鼓室硬化病理表现为结缔组织高密度的纤维化,玻璃样变性及钙化。电镜下观察进一步揭示了胶原纤维的显著增生及富含电子的钙质沉着,在纤维样改变的细胞内可见有变性的溶酶体及线粒体及钙质沉积。