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目的:观察瑞香素(Daphnetin,DAP)对TNF-α诱导的CIA大鼠滑膜细胞MAPK信号通路的调节作用,为探讨瑞香素抗风湿炎症的相关分子机制奠定基础。方法:1.筛选瑞香素对CIA大鼠滑膜细胞最佳作用浓度CKK-8法观察不同浓度瑞香素(2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml)对CIA大鼠滑膜细胞存活率的影响,为后续实验筛选出最佳药物作用浓度。2.瑞香素对TNF-α诱导的CIA大鼠滑膜细胞MAPK信号通路的调节作用研究实验细胞(除C组)均用10ng/ml TNF-α诱导30min后,分组如下:Model:CIA大鼠滑膜细胞+TNF-α(模型组)DAP:CIA大鼠滑膜细胞+TNF-α+瑞香素(瑞香素组)TP:CIA大鼠滑膜细胞+TNF-α+雷公藤(阳性药物对照组)C:CIA大鼠滑膜细胞(细胞对照组)共同培养48h后:(1)Real-time PCR检测瑞香素对TNF-α诱导的CIA大鼠滑膜细胞中IL-6、TGF-β、MMP-3、MMP-13 mRNA 表达水平的影响;(2)ELISA检测瑞香素对TNF-α诱导的CIA大鼠滑膜细胞培养上清中IL-6、TGF-β、MMP-3、MMP-13分泌情况的影响;(3)细胞免疫荧光法观察瑞香素对TNF-α诱导的CIA大鼠滑膜细胞p-p38、p-ERK1/2、p-JNK核内表达情况的影响;(4)Western blot检测瑞香素对TNF-α诱导的CIA大鼠滑膜细胞MAPK信号通路p-p38/p38、p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK/JNK蛋白的表达以及磷酸化水平的影响。结果:1.瑞香素在2.5μg/ml～30μg/ml浓度范围内,作用CIA大鼠滑膜细胞48h对滑膜细胞存活率无明显影响,在20μg/ml时存活率最高。2.瑞香素对TNF-α诱导的CIA大鼠滑膜细胞中IL-6、TGF-β、MMP-3、MMP-13 mRNA 表达水平的影响:DAP 组中 IL-6、TGF-β、MMP-3、MMP-13 mRNA的表达水平明显低于Model组(P<0.05);与TP组比无显著差异(P>0.05)。3.瑞香素对TNF-α诱导的CIA大鼠滑膜细胞培养上清中IL-6、TGF-β、MMP-3、MMP-13分泌情况的影响:DAP组中IL-6、MMP-3、MMP-13、TGF-β的分泌水平明显低于Model组(P<0.05),与TP组比无显著差异(P>0.05),其中MMP-3、TGF-β的分泌水平接近C组(P>0.05)。4.瑞香素对TNF-α诱导的CIA大鼠滑膜细胞p-p38、p-ERK1/2、p-JNK核内表达的影响:各实验组中p-p38、p-ERK1/2、p-JNK蛋白均标记为绿色荧光,荧光显微镜观察发现Model组较C组荧光强度明显增强,核内表达明显增多;DAP组中,p-p38、p-ERK1/2、p-JNK的荧光强度较Model组均明显减弱,且核内表达显著减少。5.瑞香素对TNF-α诱导的CIA大鼠滑膜细胞MAPK信号通路蛋白p-p38/p38、p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK/JNK蛋白的表达以及磷酸化水平的影响:DAP组中p-p38、p-ERK1/2、p-JNK 蛋白的表达水平与 p-p38/p38、p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK/JNK蛋白表达比率均明显低于Model组(P<0.05),p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK/JNK蛋白表达比率与C组及TP组比显著降低(P<0.05)。结论:1.瑞香素在2.5μg/ml～30μg/ml浓度范围内,作用CIA大鼠滑膜细胞48h对滑膜细胞存活率无明显影响,在20μg/ml时存活率最高。2.瑞香素(20μg/ml)可显著降低TNF-α诱导的CIA大鼠滑膜细胞中IL-6、TGF-β、MMP-3、MMP-13 mRNA 的表达水平。3.瑞香素(20μg/ml)可显著降低TNF-α诱导的CIA大鼠滑膜细胞培养上清中 IL-6、TGF-β、MMP-3、MMP-13 的分泌水平。4.瑞香素(20μg/ml)可显著降低TNF-α诱导的CIA大鼠滑膜细胞p-p38、p-ERK1/2、p-JNK在细胞核内的表达。5.瑞香素(20μg/ml)可显著降低TNF-α诱导的CIA大鼠滑膜细胞p3 8、ERK1/2、JNK蛋白磷酸化水平。综上,瑞香素可通过调节MAPK信号通路,影响MAPK信号通路的活化,降低炎症因子的表达水平,发挥抗风湿炎症作用。