背景：小RNA分子是长度为21-25个核苷酸左右的非编码的RNA (noncoding RNA, ncRNA),控制着真核细胞的许多功能,影响基因表达、细胞周期和个体发育等多种行为。小RNA主要包括微RNA(microRNA, miRNA)和小干扰RNA (short interfering RNA, siRNA)两类,其中miRNA成为继siRNA之后新的研究热点之一MiRNAs是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,其结构上主要有三个特点：(1)本身不具有开放阅读框架(ORF)及蛋白质编码基因的特点。(2)大小长约21-25个核苷酸。(3)有独特的特征序列。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的,随后组装进RNA诱导的沉默复合体,通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA,并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。研究证明,miRNA在生物体的物质代谢、细胞周期、细胞分化、凋亡、个体形态的形成和发育等一系列重要生命活动的调控过程中扮演着重要的角色。此外,miRNA与肿瘤的发生发展密切相关。大约50%的miRNA位于肿瘤相关的染色体区域,包括LOH区、染色体扩增区及脆性位点等,参与了肿瘤细胞的增殖、凋亡、粘附、血管生成等生物学过程的调控,在肿瘤发生的基因水平调控方面发挥了广泛而重要的作用。miRNA的异常表达直接参与肿瘤的侵袭和转移,现今一些作为原癌基因、肿瘤抑制基因和肿瘤转移基因的miRNA已被鉴定出来,这将有助于理解miRNA在肿瘤侵袭转移中的作用,同时也为寻找肿瘤特异性诊断的标志物和肿瘤治疗的新靶点提供了思路。病毒是专一性细胞内病原体,与多种动植物的疾病有关。病毒能否正常生长复制,关键在于它们能否抑制宿主固有免疫防御,或者逃避宿主先天性或适应性免疫清除作用,比如干扰素样反应和凋亡反应。为达到这一目的,绝大多数病毒是通过编码特异性灭活宿主细胞防御的蛋白来实现的。最近的研究证实：病毒也可能通过合成自身的miRNA来关闭自身或宿主特异性基因的表达,从而优化自身生存环境,更易导致感染或病毒相关肿瘤的发生。这种由病毒编码产生的miRNA引起了人们广泛的关注。EB病毒是第一个被发现编码miRNA的病毒。2004年,Pfeffer等首次在EB病毒中分离出小RNA属人疱疹病毒家族成员,经研究表明其在病毒感染宿主过程中起作用,他们将这些miRNA分别命名为miR-BHRF1-1、miR-BHRF1-2、miR-BHRF1-3、miR-BART1和miR-BART2,这是最早发现的病毒编码的miRNA分子。随后一年,Pfeffer等又经过计算分析与实验研究从29种病毒中识别出33条编码产生的病毒miRNA。Pfeffer等的发现使病毒miRNA研究成为一个新的研究热点,开辟了新的研究领域分支,为病毒miRNA分子调控宿主基因表达和病毒自身基因表达提供了新方向和新内容,也向病毒与宿主细胞间相互作用新模式的研究迈出了重要的一步。目前所鉴定的miRNA所属病毒绝大多数属致肿瘤病毒,因此,可以推测病毒miRNA与肿瘤关系密切。病毒致瘤新学说认为：病毒miRNA分子的序列恰好是针对宿主细胞中肿瘤抑制基因,如EB病毒miR-BHRF1具有与肿瘤抑制基因P53结合的潜在位点,与细胞凋亡调节因子Bcl-2mRNA3’端非编码区的结合位点,从而参与调控宿主细胞凋亡和细胞增殖,这可能会导致宿主抑癌基因功能的丧失和免疫监视功能的失常,最终引起肿瘤的发生。另有报道,EBV-miR-BART5与宿主细胞的PUMA基因结合,抑制细胞凋亡,60%鼻咽癌病人有PUMA表达显著下降。在调节自身基因方面,据预测,EB病毒miR-BART2是来自其DNA聚合酶(BALF5)转录本反义链,具有与BALF53’端UTR完全互补的序列,因此可能指导BALF5 mRNA降解和调控BALF5基因表达,导致宿主处于隐性感染状态。研究表明,全长5.0kb BALF5 mRNA的加工降解产物3.7 kb片段,其3’端序列与Pfeffer等人预测的miR-BART2指导的裂解位点非常吻合。此外,miR-BART2可与BMLF1 (EB2)mRNA 3’端结合,miR-BART1可与BBLF4和LMP2A mRNA的3’端结合,从而达到调节病毒自身基因表达的目的；在调节机体免疫方面,EBV-miR-BHRF1-3可与干扰素可诱导的T细胞趋化因子CXCL-11结合,逃避免疫监视。鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma, NPC)是指发生于鼻咽粘膜的恶性肿瘤。中国的广东、广西、福建、湖南等地为高发区。发病年龄大多为中年人,亦有青少年患病者。鼻咽癌恶性程度较高,早期即可出现颈部淋巴结转移。研究表明,EB病毒感染与鼻咽癌的发生密切相关,在大部分角化鳞状细胞癌和几乎所有未分化的鳞状细胞癌都有EB病毒的存在。全世界90%以上的人感染过EB病毒,但只有少部分成年后有鼻咽癌的发生,其致病机理尚不完全清楚。查阅最新文献,EBV-miRNA与鼻咽癌发生发展机制方面的研究甚少。本课题首先应用miRNAs表达谱芯片检测并筛选出鼻咽癌组织(NPC)和非癌鼻咽组织(慢性鼻咽炎,NP)中差异表达较大的EBV-miRNA,构建慢病毒表达载体,病毒包装后感染CNE1细胞,流式细胞仪分选鉴定GFP+细胞,建立了稳定过表达EBV-miR-BART7鼻咽癌细胞株,观察其对鼻咽癌的增殖、转移和侵袭等生物学行为的影响,同时通过干扰回复试验进行验证,并应用RNA-seq(转录组学)方法初步寻找可能的与转移侵袭相关的靶基因。本研究有可能为鼻咽癌发生发展的分子机制和治疗策略研究提供新思路。方法：一.应用miRNAs表达谱芯片检测NPC组织和NP组织中差异表达的EBV-miRNA。二.选取具有显著表达差异的EBV-miR-BART7做为进一步研究对象,采用Real-time PCR方法进一步验证其在NPC组织和NP组织中的表达水平。三.分析EBV-miR-BART7过表达对鼻咽癌细胞株CNE1生物学特性的影响。构建慢病毒表达载体pLVTHM/EBV-miR-BART7,病毒包装后感染CNE1细胞,流式细胞仪分选GFP+细胞,建立了稳定过表达EBV-miR-BART7的鼻咽癌细胞株CNE1-BART7,通过MTT生长曲线法检测过表达前后其增殖活性的变化,Transwell和Boyden小室实验检测细胞迁移和侵袭能力的改变,流式细胞仪检测细胞周期有无变化。四.干扰回复实验。利用脂质体转染技术将化学合成的EBV-miR-BART7阻遏物(EBV-miR-BART7 inhibitors)转染至细胞株CNE1-BART7中,通过Transwell和Boyden小室检测转染前后细胞迁移和侵袭能力的改变。五.利用RNA-seq技术,初步分析EBV-miR-BART7可能介导的候选靶基因。结果：一.miRNAs芯片结果显示,一些EBV-miRNA在NPC中的表达明显高于NP组织,其中EBV-miR-BART7差异表达变化最大,为正常组织的30倍以上,故选取其做为进一步的研究对象。二.采用Real-time PCR验证NPC组织和NP组织中ebv-miR-BART7的表达情况。NPC组织中EBV-miR-BART7的表达高于NP组织,表达差异有统计学意义(t=29.445,P<0.001)。过表达对鼻咽癌细胞株CNE1生物学特性的影响。EBV-miR-BART7三.1.MTT生长曲线结果提示：CNE1-mock细胞和CNE1-BART7细胞体外增殖能力相比差异无统计学意义(F=0.631,P=0.428)。2.细胞周期结果显示：CNE1-mock细胞和CNE1-BART7细胞的G0/G1期(t=-0.334,P=0.755)、S期(t=0.692,P=0.527)以及G2/M期(t=-0.161,P=0.880)细胞比例的差异均无统计学意义。3.迁移能力Transwell迁移实验：细胞培养17h后,CNE1-BART7细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数(100.278±19.357)多于CNE1-mock细胞(22.444±5.204),两者差异有统计学意义(t=16.475,P<0.001)。表明CNE1-BART7细胞的迁移运动能力较CNE1-mock细胞强,EBV-miR-BART7可能参与了鼻咽癌的转移过程。4.侵袭能力Boyden小室侵袭实验：细胞培养24h后,CNE1-BART7细胞穿过铺有matrigel基质胶聚碳酸酯膜的细胞数(78.900±9.132)多于CNE1-mock细胞(26.056±4.425),两者差异有统计学意义(t=22.088,P<0.001)。表明CNE1-BART7细胞侵袭运动能力较CNE1-mock细胞强,EBV-miR-BART7可能参与了鼻咽癌的侵袭过程。四.干扰回复实验1.迁移能力Transwell迁移实验：EBV-miR-BART7 inhibitor转染后24h消化细胞,细胞置于小室中继续培养17h后,CNE1-BART7-NC细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数(136.060±10.166)多于CNE1-BART7-inhibitor细胞(60.000±10.047),两者差异有统计学意义(t=22.576,P<0.001)。2.侵袭能力Boyden小室侵袭实验：EBV-miR-BART7 inhibitor转染后24h消化细胞,细胞置于带有matrigel基质胶的小室中继续培养24h后,CNE1-BART7-NC细胞穿过基底膜的细胞数(130.110±6.833)多于CNE1-B ART7-inhibitor细胞(72.560±8.459),两者差异有统计学意义(t=22.456,P<0.001)。五.宿主靶基因分析利用RNA-seq分析EBV-miR-BART7可能调控的宿主靶基因,结果显示：EBV-miR-BART7过表达后,上调基因391个,下调基因101个,它们发挥的生物学功能主要包括基质金属肽酶活性、氧化磷酸化、细胞骨架调控、细胞代谢、受体活性、细胞周期调控、ErbB、Wnt及TGF-beta等信号通路的调控以及凋亡、粘附因子、粘着斑和钙结合蛋白的调控等。由于这些生物学功能涉及到了肿瘤发生发展及侵袭转移的多个阶段,因而我们推测EBV-miR-BART7在鼻咽癌中高表达后,可通过直接或间接方式调控下游一系列靶基因的表达进而引起鼻咽癌细胞多方面生物学特性的改变,其中与转移侵袭相关的基因主要有RHOB. S100A2、NME1、TIMP1和MMPl等,与转移侵袭相关的主要信号通路有TGF-β信号通、Notch信号通、Wnt信号通以及VEGF信号通路等。结论：一miRNAs表达谱芯片、Real-time PCR检测和验证EBV-miR-BART7在NPC组织中的表达高于NP组织。二EBV-miR-BART7过表达及干扰回复实验显示,其与鼻咽癌细胞的体外转移和侵袭能力密切相关,而对细胞的体外增殖能力无明显影响。三RNA-seq分析发现EBV-miR-BART7可能通过调控下游一些靶基因的转录和翻译引起鼻咽癌细胞生物学特性的改变,参与了鼻咽癌的发生发展尤其转移侵袭的过程。