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肌肉萎缩是多种疾病的常见并发症;慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)及与其相关的炎性细胞因子刺激蛋白质能量消耗(protein energy wasting,PEW),这种复杂的过程表现为肌肉质量的持续丢失。而导致肌肉损失是一个复杂的病理生理过程,主要是加速蛋白质的降解实现的,然而这些蛋白质水解过程中的调控机制仍有待进一步研究。本课题主要研究核内小分子磷酸酶SCP4/CTDSPL2(the small C-terminal domain phosphatase 4/the C-terminal domain small phosphatase like 2)通过调节Fox O1、3信号通路影响肌肉蛋白质代谢;在CKD时由于NF-κB被激活而刺激SCP4表达增加,从而诱导肌肉蛋白降解。第一部分SCP4在肌肉蛋白代谢中的作用机制研究目的:旨在研究核磷酸酶SCP4/CTDSPL2如何通过调控Fox O转录因子影响肌肉蛋白质的代谢,为临床防治肌肉萎缩提供新的治疗靶点。方法:采用细胞电穿孔转染技术使成肌细胞C2C12的SCP4基因抑制或过表达。过表达及对照组分别转染GFP-SCP4和GFP,然后分别加入蛋白酶体和溶酶体抑制剂、IGF-1和BMP2处理细胞;在基因抑制组分别转染SCP4-si RNA(si SCP4)和scrambled(si CTL)。采用同位素检测技术检测蛋白质的分解和合成;PCR微阵列分析SCP4过表达时与骨骼肌代谢、功能及疾病相关的基因表达变化;磷酸化蛋白微阵列检测在细胞SCP4基因抑制后多种蛋白磷酸化水平的变化。采用western-blot检测各组Akt、Fox O1、Fox O3a的蛋白表达及SCP4的转染效率;Real-time PCR检测各组Atrogin-1、Mu RF-1、MUSA1、Myostatin的m RNA表达。激光共聚焦显微镜动态观察活细胞Fox O1出入细胞核的变化。采用电转染技术使局部肌肉SCP4过表达进行体内实验,免疫荧光染色观察肌纤维横截面积。结果:1)在骨骼肌细胞SCP4调控Fox Os和Smads信号通路;2)SCP4过表达促进成肌细胞蛋白水解;3)SCP4过表达促进肌肉损伤基因Atrogin-1、Mu RF-1、MUSA1和Myostatin的表达;4)过表达SCP4使Fox O1、Fox O3a去磷酸化增加,抑制其出核;5)在正常小鼠中过表达SCP4也足以引起肌纤维萎缩。结论:SCP4通过调控Fox O1、Fox O3a的出入核,增加其转录活性,从而促进损伤因子的表达,诱导蛋白质水解,肌肉萎缩。即使磷酸化Akt发生变化,过表达SCP4也能使Fox O1留在细胞核内,表明SCP4的是一种新的FOx O转录因子和蛋白水解信号转导的调节因子,可能为预防肌肉萎缩提供治疗的新靶点。第二部分抑制SCP4基因可防止慢性肾脏病诱导的肌肉萎缩目的:旨在探讨抑制SCP4基因在饥饿及慢性肾脏病诱导的肌肉萎缩中的保护作用。方法:使用电转染技术使C2C12细胞SCP4基因敲抑,建立饥饿模型,转染scrambled组(si CTL)、转染scrambled+无血清培养(si CTL-SF)组、转染SCP4-si RNA(si SCP4)组、转染SCP4-si RNA+无血清培养组(si SCP4-SF),同位素法检测蛋白降解率;建立CKD小鼠模型,采用免疫组化及western-blot检测其骨骼肌以及健康成人和CKD患者腹直肌SCP4的蛋白表达;采用电穿孔转染技术使CKD小鼠局部肌肉SCP4基因敲抑,分为4组,假手术+转染scrambled组(Sham+si CTL)、CKD+转染scrambled组(CKD+si CTL)、假手术+转染si SCP4组(Sham+si SCP4)、CKD+转染SCP4组(CKD+si SCP4),肌纤维的横截面积用免疫荧光染色观察;western-blot检测各组Akt、Fox O1、Fox O3a的蛋白表达;Real-time PCR检测各组Atrogin-1、Mu RF-1、MUSA1、Myostatin的m RNA表达。CKD相关的细胞因子IL-6,IFN-γ、LPS及其混合物和QNZ(NF-κB抑制剂)作用于C2C12细胞,检测细胞SCP4 m RNA和蛋白水平的变化;采用染色质免疫沉淀技术(Ch IP assay)来检测NF-κB(p65)蛋白是否与SCP 4基因启动子序列相关。结果:1)SCP4基因敲抑可以降低饥饿诱导的蛋白降解率,抑制Fox O1/3a的转录活性,降低肌肉损伤因子的表达;2)慢性肾脏病时肌肉中核磷酸酶SCP4表达增加,抑制SCP4基因可以防止CKD小鼠的肌肉萎缩;3)CKD相关炎性因子可以刺激肌细胞SCP4表达增加;转录因子NF-κB(p65)蛋白与SCP4基因启动子序列相关;QNZ处理C2C12细胞后,几乎完全阻断由细胞因子诱导的SCP4表达的增加。结论:CKD时NF-κB被激活从而介导SCP4的表达增加,刺激肌肉蛋白水解;抑制SCP4的表达可以预防CKD及饥饿诱导的肌肉萎缩。这一结论可能为临床防治CKD及其他代谢性疾病导致的肌肉萎缩提供新的治疗靶点。