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研究目的:本研究通过不同脱细胞方法制备不同梯度DNA、脂质以及内毒素残留量的ACTM生物材料,深入比较不同DNA、脂质和内毒素残留量与ACTM生物材料体外免疫原性、体内宿主免疫应答、材料重塑和组织再生的相关性,对ACTM生物材料中残留DNA、脂质、内毒素等可能致免疫原性的因素进行分析,确认ACTM生物材料免疫原性的关键因素,建立新的DNA残留标准,为规范脱细胞技术制备ACTM生物材料提供新的方向和标准。因此本研究分为三个部分进行:1.不同DNA/脂质/内毒素残留量ACTM生物材料制备和测定;2.不同DNA/脂质/内毒素残留量ACTM生物材料体外及体内免疫原性实验;3.不同DNA/脂质/内毒素残留量ACTM生物材料大鼠部分腹壁肌缺损修复实验。研究方法:1.不同DNA/脂质/内毒素残留量ACTM生物材料制备和测定:(1)利用猪SIS和UBM材料采用梯度递进的脱细胞方法制备出不同梯度DNA、脂质、内毒素残留量的ACTM生物材料:PAA处理SIS制备SIS-1组材料;PAA+脱脂处理SIS制备SIS-2组材料;PAA+脱脂+去内毒素处理SIS制备SIS-3组材料;PAA处理UBM制备UBM组材料;以未做脱细胞处理SIS作为阳性对照SIS-PC组;以强酸强碱过度脱细胞处理SIS作为阴性对照SIS-NC组。(2)检测各组材料的细胞成分残留、DNA、脂质、内毒素、α-Gal抗原、PAA、环氧乙烷、病毒残留等指标:HE染色观察各组材料是否有细胞核成分残留;用磁珠抽提+Picogreen法检测各组材料的DNA残留量;用索氏抽提法测定各组材料的脂肪含量;用鲎试剂并采用动态光度法(定量)和凝胶法(半定量)两种方法检测法检测材料内毒素残留量;用抑制ELISA方法进行α-Gal抗原清除率测定;用酸度计检测各组材料的PAA残留;采用气相色谱法检测材料环氧乙烷残留量;用细胞培养法验证PAA处理对各组材料的病毒灭活效果。2.不同DNA/脂质/内毒素残留量ACTM生物材料体外及体内免疫原性实验:(1)体外免疫原性实验,分别从T淋巴细胞增殖实验、B淋巴细胞增殖实验、腹腔巨噬细胞活化实验及巨噬细胞分泌炎症介质(TNF-α和NO)量等方面评价ACTM生物材料的体外免疫原性。(2)体内免疫原性实验则选择小鼠腹腔植入ACTM生物材料模型,分别评价腹腔内植入材料后外周血免疫炎性反应(包括不同白细胞种类的数量、免疫球蛋白量)、腹腔免疫炎性反应(包括腹腔液巨噬细胞数量、产生炎性细胞因子量)以及脾脏指数、脾脏细胞增殖活性(检测不同淋巴细胞亚群比例)。3.不同DNA/脂质/内毒素残留量ACTM生物材料大鼠部分腹壁肌缺损修复实验:(1)构建大鼠部分腹壁肌肉缺损模型,采用同体对照法,分别于每只大鼠两侧腹壁各造一处腹壁肌部分肌肉缺损,两侧的缺损分别用同等大小不同研究材料补片Inlay法修复;(2)术后随访观察,包括大鼠基本活动、血清肿发生、手术部位感染、腹壁膨出、死亡等;(3)观察补片皱缩情况;(4)获取组织标本行组织学检测(HE染色、Masson三色染色)、免疫组化检测(CD68、CCR7、CD206、CD3、CD19、CD4、CD8),评价修复区域的炎症细胞浸润、巨噬细胞分型及比例、淋巴细胞分型及比例以及补片降解、再生血管、再生胶原纤维等情况。研究结果:1.研究所用各组材料均无PAA残留,环氧乙烷及病毒灭活均降低至不产生显著影响水平,组间没有明显差异。除了SIS-PC组,其余各组均无细胞核成分残留,且α-gal抗原清除率无显著差异。SIS-1组材料DNA残留、脂质含量和内毒素残留水平均显著高于SIS-2组及SIS-3组材料(p<0.001)。而SIS-2组材料DNA残留量、脂质含量与SIS-3组材料相似;UBM组内毒素残留显著低于SIS-1组和SIS-2组材料,与SIS-3组材料相似,但是DNA残留和脂质含量与SIS-1组材料没有显著差异;通过前面描述的脱细胞处理方法制备出的4组研究材料DNA残留、脂质含量、内毒素残留等指标组间差距明显,四组材料特点如下:SIS-1组材料高DNA、高脂质、高内毒素;SIS-2组材料中DNA、低脂质、中内毒素;SIS-3组材料低DNA、低脂质、低内毒素;UBM组材料高DNA、高脂质、低内毒素。2.ACTM生物材料体外免疫原性实验结果显示:SIS-1组的T、B淋巴细胞增殖率均低于SIS-2组;而TNF-α、NO释放量高于SIS-2组;与SIS-2组相比,SIS-3组在T、B淋巴细胞增殖率、巨噬细胞活化率以及分泌促炎细胞因子(TNF-α和NO)方面均显著降低。UBM组、SIS-3组均没有显著提高巨噬细胞的增殖率,SIS-1组同样没有激活巨噬细胞。但TNF-α、NO的释放量与脱细胞程度正相关,SIS-2组促炎细胞因子释放量显著高于SIS-3组,而后者与UBM组无显著性差异。3.体内免疫原性实验结果显示:SIS-1组促炎细胞因子TNF-α和IFN-γ高于SIS-2组,而抗炎细胞因子IL-4和IL-10则相反;SIS-1组Th细胞比例低于SIS-2组,而CTL细胞比例则更高,SIS-1组CD4~+/CD8~+细胞比例显著低于SIS-2组;SIS-3组腹腔巨噬细胞总数显著低于SIS-2组,而且SIS-3组促炎细胞因子TNF-α和IFN-γ分泌则显著低于SIS-2,而抗炎细胞因子IL-4和IL-10分泌则相反。4.在大鼠部分腹壁肌缺损修复实验中,术后1周,SIS-1组修复区血清肿发生率为70%(21/30),SIS-2组修复区血清肿发生率为40%(12/30),而SIS-PC组修复区血清肿发生率高达90%(27/30),而SIS-3、UBM及SIS-NC组未发生。SIS-3、UBM组补片皱缩不明显,术后8周,SIS-1和SIS-2组补片皱缩显著明显高于SIS-3和UBM组,而SIS-1组补片皱缩最明显,仅剩植入面积的57.1%。SIS-1和SIS-2组修复区炎性细胞浸润程度显著高于SIS-3和UBM组。SIS-3和UBM组胶原纤维再生情况也较SIS-1和SIS-2组良好。SIS-1和SIS-2修复区的细胞浸润均以M1型巨噬细胞为主,而SIS-3和UBM组则以M2型巨噬细胞为主。SIS-1和SIS-2组修复区的M1/M2比例始终显著高于SIS-3和UBM组。SIS-3和UBM的T淋巴细胞浸润以Th为主,而SIS-1、SIS-2组均以CTL为主;术后1周、4周、8周均是SIS-1修复区的CD4~+/CD8~+细胞比例最低,SIS-2组其次,SIS-3和UBM组始终显著高于SIS-1和SIS-2组。研究结论:1.组织材料来源不同和脱细胞方法不同,可以影响ACTM生物材料内DNA、脂质及内毒素残留等潜在引起免疫反应因素。采用逐步递进的脱细胞方法可以制备出不同梯度DNA残留、脂质含量、内毒素残留量的SIS材料和UBM材料。2.ACTM生物材料体外免疫原性实验及腹腔植入ACTM生物材料体内免疫原性实验结果均显示,ACTM生物材料免疫原性与DNA残留、脂质含量无关,而与内毒素残留有关。3.大鼠腹壁肌修补模型评价结果进一步证实,内毒素残留是ACTM生物材料植入术后早期修复区炎症-免疫反应的主要影响因素。随着内毒素残留的降低,术后早期血清肿、补片皱缩等炎症反应发生率均可降低,而低内毒素生物材料植入体内后可诱导再生组织胶原纤维有序排列,促进修复区组织重塑。4.DNA残留、脂质含量不是影响ACTM生物材料免疫炎症反应和修复效果的关键因素,需要确认新的ACTM生物材料中DNA残留量标准。内毒素残留与ACTM生物材料的免疫原性密切相关,内毒素应作为衡量ACTM生物材料免疫原性和安全性的重要指标。创新点:国内外首先研究确认残留DNA是否为影响ACTM宿主-材料反应类型和免疫原性的关键因素,提出内毒素是宿主-材料反应类型决定因素,内毒素是ACTM免疫原性和安全性的重要指标。这对于ACTM材料脱细胞新的标准制定具有重要意义,对于今后ACTM生物材料在我国大规模生产研发和临床应用具有重要的意义。