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正丁醇在化工,能源和食品领域用途广泛,随着石油资源的不断匮乏,生物能源引起了人们广泛的关注,丁醇作为一种新型生物燃料,是一种理想的石油替代燃料。甘油还原度高(4.67,而葡萄糖为4),比起糖类物质作为碳源,甘油用于合成还原度高的丁醇(还原度为6)非常有利。本研究是以丙酮丁醇梭状芽孢杆菌Clostridium acetobutylicum ATCC824基因组为模板,PCR扩增thil、adhE2和BCS operon基因并克隆到表达载体pETDuet-1和pACYCDuet-1中,将构建的重组质粒pA和pBT转入到E. coli MG1655(DE3)中,经IPTG诱导表达,在含有甘油的TB培养基中微好氧发酵可产生19.0mg/L丁醇。为了提高丁醇产量,以大肠杆菌MG1655基因组为模板,PCR扩增甘油孔道运输蛋白基因GlpF并克隆到表达载体pETDuet-1,将重组质粒pAG和pBT转入到E. coli MG1655(DE3)中,经诱导表达,在相同培养基中微好氧发酵可产生33.5mg/L丁醇。在产物检测中,发现有大量的代谢副产物乙醇,琥珀酸,乳酸等生成,为进一步提高丁醇产量,用Red同源重组法敲除了大肠杆菌代谢副产物途径基因ldha, adhe, frdBC,将重组质粒导入三缺失大肠杆菌中,在相同培养基中微好氧发酵可产生97.9mg/L丁醇。为了研究代谢途径NADH对丁醇产量的影响,我们在大肠杆菌中构建了NADH再生系统,以博伊丁假丝酵母基因组为模板,克隆了甲酸脱氢酶基因FDH1,构建的菌株微好氧发酵最多可产生154.5mg/L丁醇。同时我们敲除了大肠杆菌本身的甲酸脱氢酶FDHF,然而丁醇产量却有所下降。