研究背景：组织损伤修复由复杂的生物学和分子学过程组成，包括细胞迁移、粘附、增殖以及细胞外基质的分泌。同时，越来越多的证实表明干细胞在组织修复过程中具有潜在的治疗作用。人牙髓干细胞属于间充质干细胞，定位于牙髓中的富细胞区，是牙髓损伤修复过程中的一种有效的干细胞。在牙髓炎症过程中分泌的小分子信号的诱导下，人牙髓干细胞能够向损伤部位迁移并分化成为相关的细胞从而发挥修复功能。　　在牙髓炎症过程中，有一种趋化因子 SDF-1的表达也发生了上调。另外，在肝脏、肺脏、淋巴组织和内皮细胞等组织损伤部位，有研究证实，SDF-1通过与CXCR4的结合并提高干细胞的迁移发挥修复作用。作为一种七次跨膜的 G蛋白偶联受体, CXCR4能够接收外来信号并诱导细胞内的信号传递。SDF-1与CXCR4的结合已经有研究证实，但是他们的下游信号在不同的细胞内仍然不是很明确。　　有关细胞内信号通路的研究表明，PI3K/Akt的活化参与间充质干细胞的趋化反应。抑制GSK3β的活性能够增加CXCR4的表达。同时，β-catenin参与人间充质细胞的迁移和侵袭，并且在其发生活化以后能够从细胞膜上解离下来，然后转移到细胞核内参与调节细胞骨架蛋白的表达。Cdc42属于Rho GTP酶家族蛋白，后者参与调节微丝蛋白骨架并能够影响细胞的活力。而细胞骨架的动态重建正是细胞迁移的必要条件。　　基于以上所述做出如下猜想：（1）牙髓修复过程中人牙髓干细胞的迁移受到SDF-1与CXCR4结合的诱导；（2）SDF-1可能通过PI3K/AKT和GSK3β/β-catenin信号路径调节人牙髓干细胞的迁移；（3）SDF-1诱导的人牙髓干细胞的迁移需要Cdc42的参与。本课题设计的实验正是为了证实上述猜想，并探索SDF-1/CXCR4与人牙髓干细胞迁移的关系。　　研究目标：　　1.研究SDF-1是否能够诱导人牙髓干细胞的迁移；　　2.观察CXCR4在人牙髓干细胞中的表达及SDF-1与CXCR4的结合；　　3.探究SDF-1/CXCR4诱导条件下人牙髓干细胞迁移的机制；　　4.探索Cdc42在SDF-1/CXCR4诱导的人牙髓干细胞迁移过程中的作用。　　研究方法：　　第一部分人牙髓干细胞的培养与SDF-1/CXCR4的表达及功能　　1.知情同意条件下拔出患者第三磨牙并在1小时内获得牙髓。将牙髓剪碎并置于含有3mg/mlⅠ型胶原酶的PBS中37℃条件下消化60min后，所得样品在1000r/min条件下离心5min。紧接着在PBS中再洗3遍后，将细胞置于含有15-20％胎牛血清的α-MEM中进行培养。　　2.原代细胞经消化稀释后获得单细胞克隆。传代2-3次后，将扩增获得的单克隆细胞用于流式细胞分析以确定细胞表面分子标记。经过确认的人牙髓干细胞再进行4周的成牙/成骨诱导培养后，用40mM的茜素红染色。同时，另一些人牙髓干细胞进行5周的成脂诱导并用0.3%的油红O染色。　　3.将人牙髓干细胞接种于盖玻片上过夜后，用4%的多聚甲醛在4℃条件下固定15min。经过冲洗、透膜和封闭，用抗CXCR4的一抗对细胞进行孵育。另外，Western blot同样用于检测CXCR4的表达。　　4.经过确认的人牙髓干细胞接种于Transwell小室的上层并分为4组。0、30、50、100ng/ml等4种浓度的SDF-1分别用于4组实验。细胞迁移至Transwell小室底膜下表面的细胞用于计数。　　第二部分SDF-1/CXCR4通过FAK/PI3K/AKT和GSK3β/β-catenin信号通路诱导人牙髓干细胞的迁移　　1.浓度依赖实验和时间依赖实验通过 Western blot的方法检测 FAK/PI3K/AKT和GSK3β/β-catenin信号通路中蛋白的表达变化。在浓度依赖实验中，0、30、50、100ng/ml的SDF-1作用2h，用于检测p-FAK、p-PI3K、p-Akt、p-GSK3β和β-catenin的表达变化。在时间依赖实验中，50ng/ml的SDF-1作用0、15、30、60、90min用于检测p-FAK、p-PI3K、p-Akt、p-GSK3β和β-catenin的表达变化。　　2.在细胞经50ng/ml SDF-1作用6h后，用细胞免疫荧光检测p-FAK和β-catenin在细胞水平的表达变化。　　3.对CXCR4的功能进行抑制用于观察SDF-1诱导条件下人牙髓干细胞迁移过程中CXCR4的功能。我们采用AMD3100抑制CXCR4的活性，用siCXCR4降低CXCR4的表达。抑制的效果通过Transwell实验和Western blot实验进行确认。抑制作用背后的机制通过p-FAK、p-PI3K、p-Akt、p-GSK3β和β-catenin的表达变化进行检测。　　4. LY294002用于检测PI3K/AKT在人牙髓干细胞迁移过程中的作用。PF573228用于抑制FAK并观察FAK的功能。　　第三部分Cdc42在人牙髓干细胞迁移过程中的作用　　1.将siCdc42转染入人牙髓干细胞以获得Cdc42的低表达。用ML141抑制Cdc42的活性。用实时PCR和Western blot确认敲低效果。通过Transwell和划痕实验检测抑制Cdc42活性对人牙髓干细胞迁移的影响。　　2.极性实验用于观察Cdc42敲低对人牙髓干细胞迁移过程中高尔基体和细胞核极性化的影响。Western blot用于检测其对FAK、GSK3β和β-catenin磷酸化的影响。　　3.转染了 siCdc42的人牙髓干细胞也进行 SDF-1的诱导。通过 Transwell实验观察Cdc42在 SDF-1诱导的人牙髓干细胞迁移过程中的作用。Western blot用于观察Cdc42敲低对SDF-1诱导的人牙髓干细胞中信号传递的影响。　　研究结果：　　第一部分人牙髓干细胞的培养与SDF-1/CXCR4的表达及功能　　1.原代细胞培养2周以后能够形成克隆。单克隆细胞的表面标记分子显示其属于间充质干细胞。另外，多向分化实验显示培养的细胞能够形成矿化结节和脂滴。　　2.人牙髓干细胞中CXCR4的表达在RNA、蛋白和细胞三个水平得到确认。　　3. CXCR4在人牙髓干细胞的表达在SDF-1的作用下能够发生上调。并且，SDF-1能够促进人牙髓干细胞的迁移。　　第二部分SDF-1/CXCR4轴通过FAK/PI3K/AKT和GSK3β/β-catenin信号通路诱导人牙髓干细胞的迁移　　1.在不同浓度SDF-1作用2h后，p-FAK、p-PI3K、p-Akt、p-GSK3β和β-catenin的表达表现出了浓度依赖性。在50ng/ml SDF-1的作用下，p-FAK、p-PI3K、p-Akt、p-GSK3β和β-catenin的表达表现出了时间依赖性。细胞免疫荧光显示 p-FAK和β-catenin在细胞水平的表达受到SDF-1的影响。　　2. AMD3100和siCXCR4能够抑制SDF-1诱导的人牙髓干细胞的迁移。这个现象受到p-FAK、p-PI3K、p-Akt、p-GSK3β和β-catenin的表达变化的影响。　　3. LY294002通过抑制 PI3K的活性下调人牙髓干细胞的迁移。它也参与调节PI3K/AKT和GSK3β/β-catenin通路。　　4. PF573228通过影响PI3K/AKT和GSK3β/β-catenin信号通路抑制人牙髓干细胞的迁移。　　第三部分Cdc42在人牙髓干细胞迁移过程中的作用　　1. siCdc42抑制人牙髓干细胞的迁移能力，并且能够影响迁移过程中人牙髓干细胞的高尔基体和细胞核的重定向。　　2. siRNA介导的Cdc42功能抑制通过调节PI3K/AKT信号通路和GSK3β/β-catenin信号通路降低人牙髓干细胞的迁移能力。　　研究结论：　　1. SDF-1能够促进人牙髓干细胞的迁移。　　2. SDF-1通过与CXCR4的结合促进人牙髓干细胞的迁移。　　3. SDF-1/CXCR4通过PI3K/AKT信号通路和GSK3β/β-catenin信号通路促进人牙髓干细胞的迁移。　　4. Cdc42对于SDF-1/CXCR4诱导的人牙髓干细胞的迁移是必需的。