亚硒酸钠对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响及其机制研究

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目的:观察亚硒酸钠对人增生性瘢痕(Hypertrophic Scar,HS)成纤维细胞(Fibroblast,FB)体外增殖的影响,并进一步研究经亚硒酸钠作用后的FB中转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor beta-1,TGF-β1)和Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的变化;探讨在亚硒酸钠作用FB过程中Wnt/β-catenin信号通路的变化,从而证明亚硒酸钠抑制HS中FB增殖的可能作用机制。方法:(1)HS组织取自本院整形科患者,采用改良组织块联合胰酶消化法体外培养FB;(2)取第4代FB用CCK-8试剂检测经过不同浓度(0umol/L、2.5umol/L、5umol/L、10umol/L、20umol/L、40umol/L、80umol/L)的亚硒酸钠培养基培养24h、48h、72h、96h之后各组FB的增殖情况;同等条件下,用Live/dead试剂盒检测加入不同浓度的亚硒酸钠培养基培养24h之后在荧光显微镜下观察各组FB生长情况;细胞免疫组化法检测加入上述不同浓度的亚硒酸钠培养基培养24小时后各组FB内TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型胶原,Wnt-1和β-catenin蛋白的表达情况;采用蛋白免疫印迹法检测加入上述不同浓度的亚硒酸钠培养基培养24小时后各组FB内Wnt-1和β-catenin蛋白的表达情况,以上实验均重复三次;(3)日本大耳白兔8只,建立兔耳HS的动物模型,每只兔子每只耳朵上分别建立6个1.0cmx1.0cm创面,28天后取已形成的60个HS创面随机分为三组:A:生理盐水组,B:0.1mg/ml醋酸曲安奈德组,C:20umol/L(考虑亚硒酸钠的毒性作用,本次选取一个相对安全适中的浓度)亚硒酸钠组,进行干预,在瘢痕组织块基底部每次注射上述相应溶液50ul,每3天一次,总共10次,连续性观察瘢痕的形态学变化;30天后切下标本随后进行苏木精一伊红染色观察各组瘢痕FB数量和胶原表达及排列变化。结果:(1)亚硒酸钠在0-80umol/L浓度范围内,在同一时间内随着浓度的增加,对FB的抑制率呈现逐步增加的趋势(P<0.05);在相同浓度作用下随着时间的延长,亚硒酸钠对FB的抑制率逐渐增加(P<0.05);(2)Live/dead试剂检测结果示,在0-40umol/L浓度内,随着浓度的上升,镜下可见死细胞数逐渐增加;(3)细胞免疫组化显示在亚硒酸钠0-40umol/L浓度内,随着浓度的上升,FB内TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型胶原、wnt-1以及β-catenin蛋白表达逐渐减弱,并且阳性细胞数逐渐减少(P<0.05);(4)蛋白免疫印迹结果显示随着亚硒酸钠的浓度在0-40umol/L范围内增加,wnt-1和β-catenin蛋白表达逐渐降低(P<0.05);(5)伤后7天兔耳创面已基本结痂,14天创面基本愈合,28天后96个创面中只有60个创面形成达到实验要求的HS创面;与生理盐水组比较,亚硒酸钠组、醋酸曲安奈德组瘢痕颜色变淡、厚度变薄并且质地变软,而且亚硒酸钠组瘢痕形态学上的改善优于醋酸曲安奈德组;苏木精一伊红染色示HS组织内FB数量明显高于正常皮肤并且排列紊乱,亚硒酸钠组、醋酸曲安奈德组较生理盐水组FB数量明显减少,其中亚硒酸钠组瘢痕FB减少较醋酸曲安奈德组更明显。结论:(1)亚硒酸钠在体外能抑制人HS中FB的增殖,并且可以降低FB内TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型胶原、wnt-1以及β-catenin蛋白的表达,其对抑制HS增生有积极的作用;(2)亚硒酸钠在抑制人HSFB的增殖过程中,对Wnt/β-catenin通路的抑制起到了明显的作用;(3)亚硒酸钠可抑制兔耳HS组织进一步增生。
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