家蝇天蚕素(Mdmcec)分子量约为4.0 kDa，由31～39个氨基酸残基组成，对革兰氏阴性菌和阳性菌具有较强的抑制作用，对病毒、真菌也有一定的抑制作用，有望发展为新一代肽类抗生素。本论文以家蝇为实验材料，以Mdmcec为基础，对其抗血清的制备、体外高效表达进行了较详尽的研究，并对家蝇体内的免疫和发育相关因子进行了差异筛选。 为增强Mdmcec的抗原性，利用同尾酶技术构建了Mdmcec六拷贝首尾串联的融合表达载体pQEMdmcec6，并在大肠杆菌M15中得到高效表达，包涵体蛋白经尿素变性后，利用镍螯和层析纯化了串联体蛋白，纯化量为30mg/l。将纯化蛋白免疫新西兰大白兔，成功制备了Mdmcec6串联体抗血清(命名为： anti-Mdmcec6)。ELISA实验结果表明抗6His-Mdmcec6的滴度高达1∶12400，抗Mdmcec的效价为1∶5000。Western blot分析表明，制备的抗血清不仅能特异性地识别纯化的Mdmcec，而且能特异性地识别家蝇蛋白粗提液中的cecropin。 为了高效表达可溶性的Mdmcec，本研究利用基因工程手段，构建了家蝇抗菌肽cecropin基因与硫氧还蛋白(Trx)融合的表达质粒pTRX-Mdmcec，在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效、可溶性表达。融合蛋白经镍螯和层析一步纯化，纯化的融合蛋白经肠激酶切割后，释放出具有杀菌活性的Mdmcec。重组Mdmcec经镍螯和层析和RP-HPLC得到纯化，纯化量为111.2 mg/l。Western blot检测表明，Mdmcec能被anti-Mdmcec6抗体特异性地识别。电喷物质谱(ESI-MS)分析表明，Mdmcec的分子量为4.0 kDa。圆二色谱(CD)分析其二级结构中不含β-sheet结构，由61﹪a-helix和39﹪的Random组成。液相法测定Mdmcec抑菌活性表明，Mdmcec不仅对革兰氏阴性菌E. coli K<,12>D<,31>和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus有很强的抑菌活性，而且对一些真菌也有很强的抑制作用，且对鼠血细胞无溶血作用。杂合肽CA-MA(家蝇cecropinA(1-8)和非洲爪蟾magainin2(1-12))具有广谱的抗菌活性。为了廉价生产家蝇抗菌肽cecropin和CA-MA，本实验将Mdmcec和CA-MA与家蝇泛素(ubiquitin)融合，构建了能表达天然N末端蛋白的原核表达质粒pQEUBIMdmcec和pQEUBICAMA，并在宿主菌M15中得到高效表达，表达量分别为47 mg/l和36 mg/l的融合蛋白。 为了给泛素融合蛋白的切割提供高活性的泛素C末端水解酶，并便于纯化切割后释放出的抗菌肽。本实验将果蝇泛素水解酶(FUCH)插入到毕赤酵母载体pPICZaA，在酵母细胞GS115中高效表达了C端带有6His纯化标签的FUCH，FUCH经镍螯和层析得到简易纯化，纯化量为19 mg/l。 Tricine-SDS-PAGE和活性测定表明，融合蛋白经FUCH切割后，释放出具有杀菌活性的抗菌肽Mdmcec和CA-MA，且分子量与预期大小一致。Mdmcec和CA-MA经镍螯和层析、超滤和RP-HPLC得到进一步的纯化后，获得重组蛋白分别为8.4 mg/l和6.8 mg/l。激光飞行质谱(MADU-TOF-MS)分析表明，MdmceC和CA-MA分子量分别为4032 Da和2559Da。圆二色谱(CD)分析CA-MA二级结构表明，CA-MA在水相中的二级结构不含β-sheet结构，由17.4﹪a-helix和82.6﹪的Random组成。活性测定表明重组蛋白对革兰氏阴性菌、阳性菌和真菌有很强的抑制作用，而且对小鼠血细胞无溶血作用。 为了寻找家蝇免疫调控相关因子和发育调控基因，本研究以健康家蝇三龄幼虫为对照群体，以细菌诱导后的三龄幼虫和蛹为目标群体，构建了抑制性差减文库(SSH)。对PCR筛选的部分克隆子测序，获得了359条ESTs。将ESTs进行同源性分析，获得了143条不同ESTs，可初步分为六类，第一类：13条免疫相关ESTs；第二类：18个转录因子相关ESTs；第三类：61条酶类相关的ESTs：第四类：25条受体相关ESTs；第五类：14条ESTs，其中包括发育相关、细胞调亡相关、细胞骨架和功能未知的ESTs；第六类：家蝇已经在GenBank登录的12条ESTs。总之，本论文首次成功制备了Mdmcec抗血清，为抗菌肽抗血清的制备提供了新的思路，并为抗菌肽cecropin在蛋白水平上的检测提供了分子依据；抗菌肽的体外成功的高效融合表达为抗菌肽的功能与结构研究及其应用提供了经济的表达平台；家蝇SSH文库的构建为更好地研究免疫和发育相关因子提供了分子平台。