草鱼（Ctenopharyngodon idella）是我国水产养殖的主要养殖鱼类之一。2011年产量达到420万吨（FAO,2012）。随着草鱼养殖业的发展,各种病症的频发,特别是与脂代谢相关的疾病（脂肪肝综合症）,严重制约其产业的可持续发展。本论文以具有重要经济价值的草鱼为研究对象,以与脂代谢关键酶（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）和肉碱棕榈酰转移酶I（CPT I））为研究重点,借助蛋白水平（酶学动力学特性）和分子水平（克隆、结构分析和组织表达）的手段,拟对草鱼不同组织和不同发育期的关键酶进行研究,同时从脂代谢相关酶的酶活性及其基因表达水平研讨了矿物元素铜和锌与脂代谢的关系。1草鱼G6PD的分离纯化及其动力学性质的研究本研究从草鱼肝胰脏中通过2’,5’-ADP-琼脂糖4B亲和层析和DEAE琼脂糖离子交换层析分离纯化G6PD,并研究了该酶学的分子量、最适温度、最适p H和碱性条件下的稳定性、动力学参数以及金属离子对酶活性的影响。实验发现,纯化后G6PD最终酶活性为18U/mg蛋白,纯化倍数为1066,最终纯化回收率为19.5%,亚分子量为71.85k Da。G6PD的最适温度为42℃,最适p H值为7.5和9.0。底物G6P和NADP+米氏常数（Km）值分别为0.026和0.0068m M。底物G6P和NADP+的最大反应速率（Vm）值分别为2.20和2.27mM min^-1 mg protein^-1。底物G6P和NADP+的催化效率分别为0.085和0.334×10-6 min^-1 mg protein^-1。金属离子对纯化后G6PD活性研究表明,金属离子Zn²⁺、Al³⁺、Cu²⁺和Cd²⁺对G6PD的IC50值分别为0.42、0.54、0.94、1.20和4.17m M;金属离子Zn²⁺、Al³⁺、Cu²⁺和Cd²⁺对G6PD的抑制常数Ki值分别为0.52、1.12、0.26和4.8m M。Zn²⁺、Al³⁺和Cd²⁺对G6PD的抑制为竞争性抑制,铜对其为非竞争性抑制。2草鱼CPT I c DNA的克隆与表达的研究在本研究中,我们成功克隆获得了草鱼3个CPT Iα构型（CPT Iα1a、CPT Iα1b和CPT Iα2a）和1个CPT Iβ构型。对其分子结构和功能进行了预测和分析,并且检测了它们的组织表达模式。通过将我们所获得的CPT I 4种氨基酸序列和其他鱼类及哺乳动物进行比对,发现某些重要性的氨基酸残基发生了突变或者替换。如Val19、Leu23和Ser24位点。比对发现存在2个肉碱乙酰转移酶位点（氨基酸残基区域为171-186和450-477）;多个蛋白翻译修饰位点:天冬酰胺糖基化位点Asn312;乙酰化位点Ala2;络氨酸磷酸化位点Thr313、Thr603和Tyr720;丝氨酸磷酸化位点Ser24、Ser38、Ser740和Ser748。此外,我们用TMpred软件预测了4种CPT I的跨膜域。结果表明,草鱼存在着2个不同的跨膜域（TM1和TM2）,我们推测上述氨基酸的替换或突变以及跨膜域的不同可能部分解释了不同CPT I构型对M-Co A的敏感性。同时,分析了草鱼4种CPT I构型在肝脏、脑、鳃、心脏、白肌、红肌、脾脏、肾脏、肠系膜脂肪和肠道等组织中的m RNA表达水平。结果表明,草鱼4种构型在不同组织中均有表达,但表达水平有差异。CPT Iα1a和CPT Iβ倾向于在心脏中表达,CPT Iα1b和CPT Iα2a的m RNA水平在肝脏中表达最高。3草鱼CPT I动力学性质的研究本研究中,为探究草鱼CPT I的酶动力学性质,我首先通过差速离心方法从草鱼肝脏、心脏、肌肉、脾脏和肠道等组织中分离线粒体并检测其完整性,再运用酶动力学的研究手段,对CPT I的酶学性质进行研究。在研究酶动力学前,我们对CPT I的最适反应条件进行了测定;分析了双底物不同浓度对草鱼不同组织中CPT I酶活力的变化影响。结果表明,草鱼各组织中CPT I酶活力与底物浓度变化满足底物饱和曲线,符合Michaelis-Menten模型。通过Lineweaver-Burk双倒数作图法,计算出草鱼不同组织中CPT I酶催化的底物动力学参数（Km、Vm和催化效率Cat）,底物L-carnitine的Km值在肠道中最大;底物L-carnitine的Vm值在不同组织中的大小为心脏>肠道=肝脏>脾脏>肌肉。催化底物P-Co A的Km值在心脏中最小,在肌肉中最大;催化底物P-Co A而言,Vm值在不同组织中的大小为心脏>肠道=肝脏=脾脏>肌肉。L-carnitine的催化效率Cat在心脏中最高,在肠道中最低（P<0.05）;而底物P-Co A的催化效率Cat在心脏中最高,在肌肉中最低（P<0.05）。总之,草鱼组织中的CPT I酶动力学差异可能反映了脂肪酸氧化能力的强弱。同时,也反映了草鱼CPT I酶动力学组织的特异性。4草鱼不同发育期肉碱组成和CPT I酶动力学研究本研究对4个发育期的草鱼肝胰脏和肌肉组织中肉碱组成和CPT I的动力学性质进行了研究。结果表明,肝胰脏中总肉碱（TC）含量在出膜和1月龄时水平最高,3月龄时最低,TC含量随着发育阶段发生变化。3月龄时草鱼肝胰脏中游离肉碱（FC）的水平最低,暗示大部分FC在这个阶段发生了乙酰化（AC）。在肌肉中,TC含量在出膜至3月龄时下降,然后上升至6月龄。AC/FC值是表征机体肉碱代谢变化的重要指标,肝胰脏中AC/FC在1月龄时值最大,在出膜时最小。而在肌肉中,AC/FC在3月龄时有最大值,1月龄时有最小值。AC/FC在不同组织中和同一组织不同发育阶段的差异性,暗示了代谢不同生理状态和能量的需求。在肝胰脏中,最大反应速率Vm从出膜至1月龄显著性增加（P<0.05）,再逐渐降低至6月龄。在肌肉组织中,Vm在1月龄时有最大值,约为出膜时的2倍（P<0.05）。在肝胰脏和肌肉组织中米氏常数Km在1月龄时有最大值。肉碱浓度（TC、AC和FC）在3月龄时含量最低,而在其他发育期肝胰脏和肌肉组织中浓度均保持恒定。哺乳动物和鱼类在FC/Km之间表现出不同特性,可能是由于CPT I调节机制的差异。FC浓度在检测组织中4个发育期均低于各个的米氏常数Km值,暗示草鱼饲料中需要添加肉碱保证CPT I活性不受肉碱浓度限制。5水体铜暴露对草鱼生长、脂肪沉积和脂代谢相关基因的表达及酶活性的影响设置4个不同铜水平（control、0.058、0.150和0.199 mg/l）对草鱼进行14天的暴露实验,研究水体铜对草鱼生长、脂肪沉积和脂代谢相关基因的表达及酶活性的影响。结果表明,水体铜暴露降低了鱼体肝胰脏和肌肉组织脂肪含量、抑制了生长并增加组织中铜的沉积（P<0.05）。在检测组织中,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）、6-磷酸葡萄糖脱氢酶（6PGD）、异柠檬酸脱氢酶（ICDH）、苹果酸脱氢酶（ME）和脂肪酸合成酶（FAS）酶活性及其基因m RNA表达水平随水体铜浓度增加而降低。水体铜暴露下调了脂肪甘油三脂脂肪酶（ATGL）、激素敏感性脂肪酶（HSL）、固醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP-1c）和过氧化物酶增殖体激活受体（PPARα）m RNA表达水平。水体铜暴露诱导了脂肪合成和分解相关酶的酶活性及基因m RNA表达水平的下调,这主要通过抑制脂肪生成这一主要矛盾来降低组织中脂肪的含量。6水体锌暴露对草鱼生长、脂肪沉积和脂代谢相关基因的表达及酶活性的影响设置4个不同锌水平（control、0.85、2.20和3.10 mg l-1）对草鱼进行14天的暴露实验。研究水体锌对草鱼生长、脂肪沉积和脂代谢相关基因的表达及酶活性的影响。结果表明,水体锌暴露显著性增加了肝胰脏中脂肪沉积、降低了肌肉组织脂肪沉积、抑制了生长和增加了组织中锌的含量（P<0.05）。在肝胰脏中,水体锌暴露上调了脂肪合成相关酶（G6PD、6PGD、ICDH、ME和FAS）酶活性及其相关基因（G6PD、6PGD、ME、FAS和SREBP-1c）m RNA的表达,而下调了CPT I酶活及脂肪分解相关基因（如PPARα、CPT Iα1a、CPT Iα2a和HSL）的m RNA表达。在肌肉中,随着水体锌浓度的升高,CPT I酶活性及分解相关基因（如PPARα、HSL和ATGL）表达升高,而脂肪合成相关酶（G6PD、ICDH、ME和FAS）活性及相关基因（G6PD、6PGD、ME、FAS和SREBP-1c）m RNA的表达下降。并对SREBP-1c和PPARα与脂肪生成酶和分解酶活性及其表达进行了相关性分析。水体锌暴露诱导脂代谢相关酶及其基因呈现不同的响应模式,暗示了水体锌暴露对脂代谢调控具有组织特异性。