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日粮中的蛋白质和氨基酸不仅是动物重要的蛋白质来源,而且是重要的信号分子,调控胃肠道的多种生理过程,包括肠神经系统的兴奋性、肠上皮细胞的增殖分化、肠液及胃肠激素的分泌,从而影响胃肠蠕动、营养素的消化和吸收等生理功能。它们可激活胃肠道内分泌细胞中表达的钙离子敏感受体(Calcium sensing receptor,CaSR),通过增加细胞内的Ca2+进而促进胃肠激素的产生和释放。目前,氨基酸和蛋白质影响胃肠道CaSR表达及其功能的研究主要集中在人、大鼠和小鼠等,家畜尤其是猪肠道CaS双还未见报道。猪小肠组织是否表达CaSR及其表达是否受蛋白质及氨基酸的调控尚需试验验证。近年的研究还发现,芳香族氨基酸尤其是苯丙氨酸(L-phenylalanine,Phe)和色氨酸(L-tryptophan,Trp)可以刺激STC-1细胞和小鼠小肠分泌胃肠激素,并且这种作用可能是由CaSR介导。而Phe和Trp能否调控猪小肠胃肠激的分泌,并且CaSR是否可以介导Phe和Trp的调节功能,均是需要研究的问题。为此,本论文分别设计了体内和体外的试验研究对上述一系列问题展开研究。1日粮蛋白水平对猪小肠CaSR表达及胃肠激素分泌的影响本试验旨在研究日粮蛋白水平对不同生理阶段猪胃肠道钙敏感受体(Calcium-sensingreceptor,CaSR)基因表达、血液胃肠激素分泌的影响,探讨蛋白水平与CaSR基因表达和胃肠激素分泌的关系。选择健康、体重相近约10 kg(9.57±0.64kg)杜长大三元杂交断奶仔猪、30 kg(36.47 ± 0.20 kg)生长猪和60 kg(62.30± 0.07 kg)肥育猪各18头,分阶段饲养,每阶段18头猪随机分为3组,每组6头,单栏饲养,以玉米-豆粕型日粮为基础,断奶仔猪日粮粗蛋白水平为20%(NRC标准)、17%、14%,生长猪日粮粗蛋白水平为18%(NRC标准)、15%、12%,肥育猪日粮粗蛋白水平为16%(NRC标准)、13%、10%,饲养期分别为45、30、50 d,试验结束后屠宰,采集前腔静脉血液、小肠各部位组织,测定血液中胃肠激素水平、小肠各部位组织中CaSR的表达。结果表明:当日粮蛋白水平降低后,不同阶段猪小肠CaSR基因表达下调(P<0.05),仔猪血清CCK、GLP-1和PYY浓度显著降低,生长猪血清CCK、GIP浓度也明显下降,而肥育猪只有血清GIP浓度显著降低(P<0.05);相关性分析表明,仔猪空、回肠CaSR表达与血中GLP-1和GIP显著正相关(P<0.05),回肠CaSR表达与血中PYY存在显著正相关(P<0.05);生长猪十二指肠CaSR表达与CCK显著正相关(P<0.05),而空、回肠CaSR表达则与GIP显著正相关(P<0.05);肥育猪小肠各段CaSR表达与胃肠激素无显著相关。说明,降低猪日粮蛋白水平可下调小肠CaSR基因表达和血液中CCK等胃肠激素的分泌,日粮蛋白水平对胃肠激素分泌的影响可能通过CaSR介导,这种作用随着猪的生长而逐渐减弱。但尚需进一步验证。2苯丙氨酸调控猪十二指肠胃肠激素分泌的机制苯丙氨酸是机体的必需氨基酸之一,可以通过激活CaSR调控人和鼠小肠胃肠激素分泌。本试验以猪的十二指肠为材料,采用表面灌流系统,主要探讨苯丙氨酸是否可以促进胃肠激素的的分泌、CaSR是否介导苯丙氨酸调控猪十二指肠胃肠激素的分泌及其内在发挥作用的下游信号通路。结果发现,苯丙氨酸可以显著促进CCK等胃肠激素的分泌,显著上调了CaS 及胃肠激素基因的表达(P<0.05),并显著提高CaSR及其下游信号蛋白的表达(P<0.05);NPS 2143是CaSR的特异性拮抗剂,其可以显著抑制苯丙氨酸引起的CCK、GLP-1和GIP的分泌(P<0.05),显著下调苯丙氨酸诱导的CaSR及胃肠激素基因的表达(P<0.05),并显著抑制了 CaSR及其下游信号蛋白的表达(P<0.05)。Ca2+是CaSR的天然性配体,其可以显著促进苯丙氨酸引起的胃肠激素的分泌(P<0.05),上调CaSR和胃肠激素基因的表达(P<0.05)。综上所述,苯丙氨酸对猪十二指肠胃肠激素具有促分泌作用,这种作用可能是通过激活CaSR,进而启动G蛋白偶联的信号转导,通过激活PKC、IP3R和PKA实现。3色氨酸调控猪十二指肠胃肠激素分泌的机制色氨酸不仅是重要的营养必需氨基酸,也是重要的信号分子。在机体的多种生理过程中发挥调控作用。研究发现,色氨酸是CaSR的营养源性配体,可以激活CaSR,进而调控多种生理过程,包括胃肠激素的分泌等。本试验利用表面灌流系统灌流猪的十二指肠,研究色氨酸调控猪十二指肠胃肠激素分泌的规律及内在机理。结果发现,色氨酸可以显著促进十二指肠CCK、GLP-1、GIP的分泌(P<0.05),显著上调CaSR及CCK、GIP、PYY的基因表达(P<0.05),上调了 CaSR及其下游信号蛋白的表达(P<0.05);NPS 2143是CaSR的特异性拮抗剂,其可以显著抑制色氨酸引起的CCK、GLP-1、GIP的分泌,下调Trp调控的CaSR和胃肠激素(CCK,GIP,PYY)基因表达(P<0.05),抑制CaSR及其下游信号蛋白的表达(P<0.05);而Ca2+是CaSR的天然性配体,其可以显著的促进色氨酸引起胃肠激素的分泌(P<0.05),上调色氨酸诱导的CaSR和CCK、GIP的基因表达(P<0.05)。本试验结果说明,色氨酸可以促进猪十二指肠胃肠激素的分泌,这种促分泌作用可能是通过激活CaSR,启动G蛋白偶联的下游信号转导,活化PKA、PKC及促进IP3与IP3R的结合,引起细胞内Ca2+动员实现的。