前言糖皮质激素具有良好的抗炎、免疫抑制作用,在骨科中对类风湿骨性关节炎,脊髓损伤有良好的治疗效果,临床上应用广泛。随着临床应用的增多,缺血性骨坏死发生率明显上升,是非创伤性缺血性骨坏死首要诱发因素,但其引起缺血性坏死的详细机理还不是十分清楚。目前糖皮质激素引起缺血性骨坏死的发病机理主要包括：骨髓中脂肪严重蓄积,造成骨内高压,血流灌注降低；血小板增多,粘滞性增大,使髓内静脉瘀滞,骨内压上升,骨内血流减少,骨细胞坏死；间充质细胞受损,成骨细胞的祖代细胞来源减少,向成骨、软骨细胞分化障碍,骨修复重建与骨吸收不能维持动态平衡。其中,对于糖皮质激素引起的髓内脂肪蓄积是由机体脂肪代谢异常在髓内形成的的脂肪沉淀,还是由于激素直接作用于骨髓间充质细胞,使细胞发生了脂肪分化以及具体生成的过程目前还没有定论。骨髓间充质细胞(Bone Marrow Mesenchymal Cell, BMSC)是存在于骨髓中的一种具有多向分化潜能的干细胞,能够分化为中胚层和神经外胚层来源的多种组织细胞,包括成骨细胞,软骨细胞,脂肪细胞和神经细胞等。研究报道,体外培养的BMSC可以在体外、体内向成骨细胞、脂肪细胞分化,且这种分化会随着体内外微环境的变化而发生改变,而糖皮质激素对细胞的成骨和脂肪分化有着显著影响。骨髓间充质细胞在向各种组织细胞分化中受多种因子的调控,目前已知的调控细胞成骨分化的关键因子Runχ2和脂肪分化早期的特异性因子(PPARγ-2)的出现与表达的变化,均能够客观反应骨髓间充质细胞分化进程,决定骨髓间充质细胞的分化方向。本课题通过地塞米松对骨髓间充质细胞脂肪分化和成骨分化的影响,探讨糖皮质激素引起骨坏死的发生机理,阐述骨髓间充质细胞的脂肪生成在非创伤缺血性骨坏死发生中的作用和影响。并通过进一步观察糖皮质激素对Runχ2基因转染骨髓间充质细胞的成脂分化作用,探讨成骨调控基因过表达时,糖皮质激素对骨髓间充质细胞分化作用的效果。立题一：糖皮质激素对骨髓间充质细胞分化的作用骨髓间充质细胞具有多向分化潜能,在不同的培养条件下,能够分化成多种组织和细胞,在体外正常培养中,大多数BMC能够分化为成骨细胞。本实验以剂量和时间方式观察地塞米松对骨髓间充质细胞分化的影响,同时观察地塞米松对细胞和细胞内细胞器形态学上的显微及超微变化的影响。立题二：地塞米松影响骨髓间充质细胞Runχ2和PPARγ-2基因的表达基因Runχ2是调控骨髓间充质细胞向成骨分化的关键性因子；PPARγ-2是脂肪细胞早期特异性标志因子。基因表达的不同代表了细胞分化方向的不同。本立题通过检测成骨基因(Runχ2)和成脂基因(PPARγ-2)mRNA和蛋白的表达,阐述地塞米松在基因和蛋白水平上对骨髓间充质细胞分化的影响。立题三：上调Runχ2对糖皮质激素诱导骨髓间充质细胞成脂分化的抑制作用在糖皮质激素促进骨髓基质细胞脂肪分化,抑制成骨分化过程中,成骨基因Runχ2表达减少,成脂基因PPARγ-2表达增高。如何拮抗糖皮质激素对骨髓间充质细胞的这种作用,从而为临床上应用糖皮质激素引起的缺血性骨坏死找到解决方法。本立题利用基因转染技术,检测Runχ2基因转染骨髓间充质细胞后,成骨标志性因子(ALP.Col I和OCN)基因mRNA的表达,探讨大剂量糖皮质激素对基因转染后的细胞成脂分化的作用。材料与方法立题一：糖皮质激素对骨髓间充质细胞分化的作用1、骨髓间充质细胞的分离、培养取3-4周龄SD大鼠双侧股骨和胫骨,10%FBS低糖DMEM培养液冲洗骨髓腔,过滤,离心,培养,0.25%胰酶消化传代培养。2、碱性磷酸酶染色和SudanⅢ复染含有不同浓度地塞米松培养液培养骨髓间充质细胞,碱性磷酸酶、SudanⅢ复染,观察SudanⅢ染色的脂肪细胞和碱性磷酸酶染色阳性成骨细胞数量变化的关系。3、细胞形态学的变化倒置相差光学显微镜和透射电镜观察地塞米松刺激后,细胞和细胞内细胞器形态上的显微及超微变化。4、细胞碱性磷酸酶活性检测改良的Kaplow氏法检测：分别以剂量方式和时间方式的地塞米松对细胞碱性磷酸酶活性的影响,比较不同组别的吸光度值差异。5、MTT方法检测地塞米松对细胞增殖的影响：检测各组细胞的吸光度值,比较不同浓度地塞米松对细胞增殖能力的抑制效果。立题二：地塞米松对骨髓间充质细胞Runx2和PPARγ-2基因表达的影响1、运用Real-Time PCR方法,检测成骨基因(Runx2)和脂肪基因(PPARγ-2) mRNA的表达：比较不同浓度地塞米松对骨髓间充质细胞分化的作用。2、Western blot印迹法检测成骨分化Runx2蛋白的表达：从蛋白表达变化上说明大剂量地塞米松抑制骨髓间充质细胞的成骨分化。立题三：上调Runx2对糖皮质激素诱导骨髓间充质细胞成脂分化的抑制作用1、构建pCMV/flag-Runx2质粒2、pCMV/flag-Runx2质粒转染骨髓间充质细胞,分别采用Western blot印迹和RT-PCR法以及免疫荧光化学方法确定重组质粒的转染是否成功。3、通过RT-PCR方法检测Runx2基因转染间充质细胞后,成骨分化标志性基因(ALP, ColⅠ、OCN)和脂肪分化基因(PPARγ-2、aP2)的mRNA表达；同时在高表达Runx2基因的情况下,大剂量地塞米松对上述基因表达的影响。4、Western blot印迹测定地塞米松对Runx2基因转染后,骨髓间充质细胞骨钙素表达的影响。实验结果1、地塞米松刺激后,细胞形态和排列发生变化,早期,细胞由梭型变为多角形或不规则性,出现细胞团聚,改变其致密的排列,团聚的细胞折光性增强。后期,细胞团聚现象消失,细胞形态呈圆型,细胞稀疏。2、随着地塞米松浓度增高,细胞内SundanⅢ着色的脂肪颗粒明显增加3、对照组的碱性磷酸酶活性与10-8 10-7 10-6M的地塞米松中,增高分别为1.57,4.49,5.0倍。4、电镜显示：细胞核缩小,核膜皱折增多,核内染色质发生固缩,电子密度增强,胞质明显减少。5、地塞米松减少Runχ2的表达88-37%(P<0.05),增加PPARγ-2的表达108-230%(P<0.05)；明显减少Runx2蛋白表达,(P<0.05)。6、.Runχ2基因转染后,细胞Runx2mRNA表达增加257%(P<0.05),下游成骨基因的表达增加明显(P<0.05)；PPARγ-2的表达减少76%(P<0.05)。结论1、地塞米松促进骨髓间充质细胞的脂肪分化,抑制成骨分化。2、地塞米松通过减少成骨调控因子Runχ2,增加脂肪分化因子PPARγ-2的基因和蛋白表达,促进细胞脂肪分化,抑制其成骨分化。3、Runχ2基因修饰的骨髓间充质细胞对地塞米松的促脂分化作用具有拮抗效果。