论文部分内容阅读
氯霉素（CAP）是一种高效广谱抗生素,其结构类似物有甲砜霉素（TAP）、氟苯尼考（FFC）及其衍生物。由于氯霉素类抗生素（CAPs）在杀菌和抑制细菌生长方面有良好的效果,且价格低廉,所以被广泛应用于动物、人类和家禽等疾病的控制。氯霉素类抗生素对人体具有极大的毒副作用,被列为禁止使用药物,因此丰富氯霉素类抗生素特征拉曼光谱和建立高特异性、高灵敏度的免疫快速检测方法具有重要的理论和现实意义。本文研究主要包括氯霉素类抗生素非特异性拉曼快速鉴定、胶体金免疫层析试纸条的组装和检测体系的评价以及结合拉曼表面增强效应（SERS）高灵敏、可定量和胶体金免疫层析试纸条高特异性、快速简便的拉曼标记免疫层析检测方法的建立。具体研究内容如下:1.基于SERS的氯霉素类抗生素快速鉴定通过对金（Au）、银（Ag）、银包金（Ag@Au）纳米粒子结构的表征及其SERS增强因子（EF）的计算,得到了分散性好、增强效果好的纳米粒子。以氯霉素为研究对象,选用金溶胶作为增强基底、乙醇作为溶剂、锡箔纸作为固相检测载体,对氯霉素类抗生素拉曼信号具有很好的检出。以氯霉素类抗生素浓度为横坐标,以氯霉素1348cm-1、甲砜霉素1593cm-1、氟苯尼考1142cm-1处特征峰强度为纵坐标,在1μM-0.1M的浓度范围内,具有良好的线性关系。2.胶体金免疫层析试纸条的组装、优化及体系评价通过间接ELISA和间接竞争ELISA法测得CAPs多残留单克隆抗体的效价位为64000,氯霉素IC50为0.87μg/m L,甲砜霉素的IC50为0.23μg/m L,氟苯尼考的IC50为2.5μg/m L,其ELISA检测方法的检测下限（LOD）分别为0.21、0.035、0.48μg/m L。选择GL-b02样品垫和Ahlstrom8964结合垫和其处理处的优化,组装成胶体金免疫层析试纸条。以出现明显颜色变化为检测下限,得:氯霉素、甲砜霉素检测下限为50ng/m L,氟苯尼考为25ng/m L,三种混合溶液的检测限更低,其重复性、稳定性、特异性均良好。3.拉曼标记免疫层析试纸条的组装、优化及体系评价选用4-MBA作为拉曼信标分子,以金、银、银包金三种纳米溶胶作为基底,以稳定性和拉曼增强效应为标准,选择银包金作为增强基底,通过偶联CAPs多残留抗体和4-MBA,组装成拉曼标记免疫探针,并进行优化。在胶体金免疫层析试纸条的基础上,组装拉曼标记免疫层析试纸条,并对该试纸条进行评价。研究结果显示在浓度0-256ng/m L范围内,氯霉素浓度对数与抑制率有较好的线性关系,标准曲线y=-0.3069x+1.7431,R2=0.994;IC50为18.4ng/m L,LOD为2.6 ng/m L;甲砜霉素浓度的标准曲线为y=-0.2932X+1.6443,R2=0.998,IC50=13.9ng/m L,LOD=2.0ng/m L;氟苯尼考标准曲线y=-0.3226X+1.809,R2=0.984,IC50=18.9ng/m L,LOD=3.1ng/m L。此外,对该检测体系进行方法学评价,包括精密度、特异性、稳定性。结果显示该方法对氯霉素检测的批内变异系数在3.7%-9.1%之间,批间变异系数在5.8%-13.8%之间。该方法与体系中其他主要蛋白和小分子交叉反应率都小于1%,特异性较好。氯霉素回收率在91.5%-105%范围内。拉曼标记免疫层析检测方法可以提高检测的灵敏度和特异性,通过更换偶联在纳米溶胶上的抗体种类,可以检测其它物质,在食品安全检测中有重要的实际应用价值。