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本文比较系统地研究了长石莼(缘管浒苔)细胞转化与表达系统:1)长石莼(缘管浒苔)离体细胞再生系统研究;2)长石莼(缘管浒苔)生长关键生态因子与条件优化;3)草丁膦抗性基因(bar)在长石莼(缘管浒苔)细胞中导入与表达;4)绿色荧光蛋白(ZsGreen)基因在长石莼(缘管浒苔)细胞中导入与表达。这为今后建立我国石莼和浒苔的转化与表达系统奠定了基础。
首先,研究了长石莼(缘管浒苔)离体细胞再生系统以及分化发育途径。采用酶解技术将长石莼(缘管浒苔)叶片细胞分离为单细胞,通过细胞培养观察离体单细胞再生以及各种分化发育途径。研究发现长石莼(缘管浒苔)主要存在3种分化发育途径(6种类型):1)部分原生质体可直接分裂形成单细胞苗。其中包括有假根和无假根2种类型。2)部分原生质体分裂成细胞团,其中包括不规则细胞团和规则细胞团2种类型。不规则细胞团的子细胞均可直接形成小苗而成苗簇,规则细胞团囊壁较薄,类似孢子囊/配子囊,但不释放孢子/配子,而是以子细胞直接萌发小苗形式发育,最后形成苗簇。3)部分原生质体可发育为孢子囊/配子囊2种类型,其中部分孢子囊/配子囊成熟后释放出游孢子/配子,孢子直接形成小苗,而配子可进一步接合为合子直接形成小苗。大部分配子是以正面结合,少数也可以首尾交错结合。并观察到某些配子也可直接形成小苗。
其次,利用脉冲振幅调制叶绿素荧光仪研究了不同光照和温度对长石莼(缘管浒苔)藻体生长及光合作用的影响,进而对藻体生长培养条件进行了优化。结果表明,长石莼(缘管浒苔)在25℃和72μmol·m-2·s-1条件下,其Fv/Fm、Fm、Fv、α和生长率值最高,分别高达0.74、4567、3406、0.305和228%,低于该点为光不饱和,高于为光抑制,偏离越大,光合作用和生长越受影响,下降越显著(P<0.01),其中在5℃和35℃时最小,分别是25℃最高值的9.88-64.88%和22.99-53.44%;光强为18μmol·m-2·s-1和216μmol·m-2·s-1时最小,其Fv/Fm、Fm、Fv、α和生长率分别是25℃72μmol·m-2·s-1最高值的7.02-82.62%和51.82-76.72%。F0变化不太明显,5-30℃为先上升后下降或再上升变化趋势,35℃为先下降后上升变化趋势。拟合参数α显示,长石莼(缘管浒苔)在达到光饱和点前通过增加光能吸收来增强光合作用,在光抑制后则迅速减少。rETRmax Duncan检验表明,高温/低温和高光强对长石莼(缘管浒苔)光合作用影响显著(P<0.01)。总体上看,长石莼(缘管浒苔)光合作用和生长适宜条件为15-25℃和54-72μmol·m-2·s-1,过高或过低均不适宜,且温度排序为25>20>15>30>10>5>35℃,光照强度排序为72>54/108>36/162>18/216μmol·m-2·s-1。
再次,通过PEG法介导将含有bar抗性筛选基因的pSVB载体导入到原生质体中并获得稳定表达,成功地建立了bar基因抗性筛选转化体系。将构建的含有bar抗性筛选基因(启动子为SV40)的pSVB载体通过PEG法介导导入到Ulva linza原生质体中,通过细胞培养再生成株。1周后用含有5ppm BastaVSE培养液进行压力筛选,成功筛选到抗Basta的转化细胞(或藻株),且相对转化率达到了31.58%。继续将含Basta VSE培养液对转化小苗进行压力筛选,并从中挑选出阳性藻株进行bar基因PCR分子检测,发现压力筛选1个月和12个月的转化藻体总DNA均得到了预期的阳性信号,其序列与GenBank中一致;进一步用Southern杂交检测,也发现转化藻株基因组DNA中同样获得阳性信号。表明bar抗性筛选基因在启动子SV40作用下可以获得瞬间表达,并也获得了稳定表达,成功建立了转基因藻株的抗性筛选体系。
最后,利用构建的含有绿色荧光蛋白基因达到载体PSV-bar-ZsGreen导入到原生质体中并得到表达,以建立转基因藻株绿色荧光蛋白检测体系。应用PCR方法扩增了pZsGreen1-N1质粒荧光蛋白片段,并构建了带绿色荧光蛋白ZsGreen为检测基因的表达载体PSV-bar-ZsGreen。通过PEG法转化长石莼(缘管浒苔)原生质体,并通过培养再生了转基因植株,应用OLYMPAS IX71荧光倒置显微镜检测到了发绿色荧光的转化藻株,表明获得瞬间表达,进一步对培养1个月的转化藻株进行ZsGreen基因PCR分子检测,获得了阳性信号。表明ZsGreen基因在CMV35s和SV40为启动子作用下,能够获得瞬间表达,ZsGreen基因可以作为大型绿藻基因工程新的检测报告基因。