背景脊髓是机体大脑和外部世界连接的桥梁。脊髓感觉神经元将外界信息传入大脑,脊髓运动神经元则控制肌肉而产生相应的行为反应。研究表明,在神经系统的衰老过程中,20–40%的皮质、海马和周围神经元具有DNA损伤增加和β-半乳糖苷酶活性升高等衰老样特性。我们一直关注衰老小鼠的脊髓变化,研究脊髓（神经元）衰老的表现和机制。然而,目前对于脊髓和脊髓运动神经元衰老变化知之甚少。最近有研究发现,“线粒体未折叠蛋白反应（mitochondrial unfolded protein response,mito UPR）”在衰老过程中发挥重要作用。mito UPR,是指线粒体功能受损或线粒体内堆积大量未折叠蛋白时,细胞会启动的应答机制,即线粒体内分子伴侣HSP60、HSP10和蛋白降解酶CLPP、LONP1的表达量迅速上调,协助蛋白质正确折叠的同时,降解错误折叠蛋白,以促进损伤线粒体的蛋白稳态恢复和细胞存活。在线虫,果蝇和小鼠体内实验数据证明,mito UPR激活可促使mito UPR标记分子HSP60蛋白表达上调,竟能起到促进机体健康和延缓衰老的奇效。这些结果给了我们重要的提示,即mito UPR可能参与了脊髓的衰老过程。在寻找调控mito UPR可能的上游信号途径的时候,我们获得了重要线索,酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）启动的信号途径调控线虫寿命,有可能是通过激活mito UPR实现的。这使得我们将NAD⁺与mito UPR联系起来考虑。NAD⁺是参与细胞能量代谢的酶以及细胞对氧化应激的适应性反应的辅助因子。最新研究表明,人脑中NAD⁺含量随年龄增长而下降,增加了NAD⁺含量,提高了衰老小鼠的机体功能。在衰老领域研究,NAD⁺作为细胞信号途径中起关键调节作用的,最受关注的是其参与调控sirtuin家族（SIRTs）酶促反应。其中,SIRT3是SIRTs家族中独特的一员,SIRT3定位于线粒体,并会在响应细胞应激时转位到细胞核中,调控线粒体稳态。相比于其他成员,越来越多证据表明,SIRT3与人类寿命延长的关系更加紧密,是延缓细胞和组织衰老必不可少的因素。并且,SIRT3参与线粒体蛋白稳态调节,在神经退行性疾病中表现出神经保护作用。以上这些研究,提示我们值得重点关注NAD⁺-SIRT3信号途径在脊髓衰老过程中的作用,并且挖掘其下游的调控方式。综上所述,mito UPR与NAD⁺在机体的衰老过程中扮演了重要的角色。在衰老小鼠的脊髓中,与线粒体密切相关的NAD⁺代谢与mito UPR的作用却并不明确。我们提出如下假设:脊髓的衰老程度与年龄依赖性的NAD⁺含量下降密切相关,衰老小鼠的脊髓中NAD⁺含量下降,抑制了线粒体SIRT3功能,并进一步导致mito UPR强度减弱,参与了脊髓（神经元）的衰老进程。我们将采用NAMPT抑制剂（FK866）腹腔注射年轻小鼠和年老小鼠,观察NAD⁺-SIRT3信号通路和mito UPR之间的联系;在体外培养的运动神经元NSC-34细胞上,建立细胞衰老模型,观察NAD⁺-SIRT3信号通路和mito UPR在神经元衰老中的变化;观察给与FK866处理,降低NAD⁺含量,削弱NAD⁺-SIRT3信号通路,抑制mito UPR,促进神经元衰老的效果;并补充NAD⁺前体物质烟酰胺单核苷酸（NMN）,评价NMN抗神经元衰老的效果。目的通过本项研究,将深入揭示小鼠脊髓的衰老过程中的病理生理机制,阐明mito UPR与NAD⁺在脊髓的衰老过程中的作用,并初步探讨其可能的抗衰老方式,以期为临床应用提供新的思路。方法（1）体内实验部分:取2月龄和19月龄SPF级雄性C57BL/6小鼠,隔日腹腔注射一次（FK866 0.5 mg/kg）。对照组注射相应剂量的溶剂。小鼠分为四组:（1）3月龄+溶剂组（n=10）;（2）3月龄+FK866组（n=10）;（3）20月龄+溶剂组（n=10）;（4）20月龄+FK866组（n=10）。一个月后,麻醉小鼠后分离出整条脊髓,用于检测NAD⁺含量和Western blot检测NAMPT、SIRT3、HSP60、HSP10、CLPP、LONP1和P53蛋白的表达。另外取6月龄和12月龄SPF级雄性C57BL/6小鼠脊髓,与3月龄和20月龄小鼠脊髓,一并用于Western blot检测HSP60、HSP10、CLPP、LONP1蛋白的表达。（2）细胞实验部分:培养小鼠脊髓前角运动神经元NSC-34细胞,CCK-8检测FK866与NMN对于细胞增殖的影响;建立H₂O₂诱导的NSC-34细胞衰老模型。分组如下:Control、H₂O₂、FK866、NMN、NMN+FK866。SA-β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况,NAD⁺试剂盒检测NAD⁺含量变化,Western blot检测NAMPT、SIRT3、HSP60和P53的表达量,免疫荧光检测HSP60的表达情况。结果（1）体内实验部分:Western blot检测发现3、6、12、20月龄的小鼠脊髓mito UPR相关蛋白表达随着年龄增加而降低。相比于3月龄组,20月龄组小鼠的LONP1、HSP60、CLPP和HSP10蛋白的表达量显著降低。相比3月龄+溶剂组,3月龄+FK866组的LONP1、HSP60、CLPP、HSP10、NAMPT、SIRT3蛋白表达量和NAD⁺含量均显著降低,P53蛋白表达量显著升高;相比20月龄+溶剂组,20月龄+FK866组的上述检测指标均呈现相似的改变;以上数据显示FK866加速小鼠脊髓的衰老进程。（2）细胞实验部分:（1）采用H₂O₂诱导运动神经元NSC-34细胞建立衰老模型;H₂O₂组比对照组SA-β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率显著升高,P53蛋白表达升高;NAD⁺含量和NAMPT、SIRT3蛋白表达水平明显减少;mito UPR标记分子HSP60表达量下调;（2）用FK866处理NSC-34细胞,SA-β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率显著升高,P53蛋白表达升高;NAD⁺含量和NAMPT、SIRT3蛋白表达明显减少;mito UPR标记分子HSP60表达下调;用NMN预处理后,逆转了FK866的促衰老作用,SA-β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数、NAD⁺含量和HSP60蛋白表达等恢复至接近正常水平。结论（1）随着年龄的增加,mito UPR减弱,NAD⁺-SIRT3信号通路功能降低,参与了小鼠脊髓（神经元）的衰老进程;（2）FK866处理,降低NAD⁺的水平,进一步减弱了mito UPR,加剧了脊髓（神经元）的衰老进程;（3）NMN处理,提高了NAD⁺水平,具有抗运动神经元衰老的效果。