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天然提取物是具有生物活性化合物的重要来源,红景天生长在海拔较高的高寒无污染地带,生长环境恶劣,具有很强的生命力和特殊的适应性。其提取物已经在商业上被用于提高能量、缺氧耐受力等。近年来的研究发现,从红景天提纯的有效成分红景天苷(对羟基苯乙基-O-β-D-葡萄糖苷)具有广泛的生物活性,包括抗氧化、抗炎、抗疲劳、心脏和神经保护作用等,并发现红景天苷类似物如半乳糖型红景天苷的生物活性更为优越,但目前酶法大量获得该化合物的产率较低。酶法合成糖苷的特点是具有区域选择性和立体选择性,可以催化一步合成特定的糖苷产物,且反应条件温和,环境友好。糖苷酶和Non-Leloir型糖基转移酶催化糖基化反应的途径简单,底物廉价,酶的来源广泛且易获得,因而受到广泛关注,被用于催化糖基化反应。β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,EC 3.2.1.23)是一类重要的糖苷酶,能够催化β-半乳糖苷键的水解,有些种类的β-半乳糖苷酶也具有合成糖苷键的作用,被工业上用来生产低聚半乳糖,并且转糖基活性已被延伸用于合成多种糖苷化合物。环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase,EC 2.4.1.19)是一类 Non-Leloir 型糖基转移酶,能以淀粉为底物,水解生成少量的葡萄糖和以α-(1→4)-键连接的低聚葡萄糖,同时可以生成α-/β-/γ-环糊精,也能以淀粉为糖基供体催化糖苷合成反应。本论文采用来源于阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5的β-半乳糖苷酶高效合成了半乳糖型红景天苷,为该类化合物的规模化生产奠定了基础;同时本论文应用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的环糊精葡萄糖基转移酶合成了多种新型的红景天苷衍生物,在新药筛选方面有潜在的应用价值。前期工作中已经将阴沟肠杆菌B5的β-半乳糖苷酶基因(GenBank Na DQ266449.1)插入pET-15b载体中,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,本论文大量制备纯化该重组酶,以乳糖为糖基供体,以对羟基苯乙醇为受体建立转糖基反应,HPLC和TLC结果显示该酶合成了三种糖苷产物(命名为P1、P2、P3)。进一步研究了乳糖、对羟基苯乙醇、反应pH、反应温度和反应时间对BgB5所催化的对羟基苯乙醇糖基化反应的影响。结果显示,最佳的反应条件为:乳糖浓度1000 mM,对羟基苯乙醇浓度为250 mM,反应pH为7.5,反应温度为50℃,反应时间为5分钟,此时三种对羟基苯乙醇衍生物的最高产率为50.0%,其中半乳糖型红景天苷所占比例为39.4%,其他两种衍生物为10.6%。将三种糖苷产物进行分子筛Bio-ge1 P2、制备型薄层层析纯化,经由质谱分析后得知P1产物分子量为300,是单糖苷衍生物,P1和P2产物分子量均为为462,是双糖苷衍生物。NMR解析得到单糖衍生物P1的结构为对轻基苯乙基-β-D-半乳糖昔;双糖苷P2和P3的结构分别为为对羟基苯乙基-β-D-半乳糖基-(1→6)-β-D-半乳糖苷、对羟基苯乙基-β-D-半乳糖基-(1→3)-β-D-半乳糖苷,是新合成的对羟基苯乙醇衍生物。首次从枯草芽孢杆菌中经过硫酸铵分级沉淀、DEAE阴离子交换层析、Source 15Q阴离子交换层析、Sephadex G-200等主要方法纯化出α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGTase)。α-CGTase为二亚基蛋白,SDS-PAGE显示其单基分子量约为70.4 kDa。通过测定α-环糊精的生成活性显示,α-CGTase的最适pH为7.5,在pH 6.5～pH 8.5范围内稳定;最适温度为55℃,在温度为50℃～60℃范围内酶活较高且比较稳定。Zn2+、Ca2+和Na+对α-CGTase的水解酶活具有轻微的促进作用,而Ni+、NH4+则对α-CGTase的酶活具有抑制作用。α-CGTase在以可溶性淀粉为糖基供体时,具有较为广泛的糖基受体选择性,可以对七叶苷、白藜芦醇、红景天苷、甜菊苷等进行糖基化反应。进一步研究了α-CGTase糖基化红景天苷的反应,TLC和HPLC显示该酶合成了 6种红景天苷衍生物(命名为S1-S6)。在该转糖基反应中,研究了淀粉浓度、红景天苷浓度、反应pH、反应温度和反应时间对α-CGTase所催化的红景天苷糖基化反应的影响,结果表明,酶在可溶性淀粉浓度为100 g/L、红景天苷浓度为50 mM、反应pH为7.5的反应体系中,于55℃反应2小时,合成的产物总产量最高,为 85.9%,6 种产物的产率分别为 34.5%、21.6%、14.8%、7.5%、4.7%、2.8%。将红景天苷的六种衍生物经过分子筛Bio-ge1 P2、高效液相色谱HPLC和制备型薄层层析方法纯化得到,经由质谱分析后得知衍生物S1的分子量为462,衍生物S2的分子量为624,衍生物S3的分子量为786,衍生物S4的分子量为948,衍生物S5的分子量为1110,衍生物S6的分子量为1272,随后经过NMR核磁共振解析得到S1的结构为对羟基苯乙基-β-D-葡萄糖基-(1→4)-α-D-葡萄糖苷。根据α-CGTase的催化特性推测,其余五种为α-CGTase糖基化红景天苷所产生的糖单元为α-(1→4)-葡萄糖基的二糖、三糖、四糖、五糖和六糖衍生物。