论文部分内容阅读
细菌(特别是放线菌和粘细菌)能够生产大量具有良好生物活性的天然化合物,这些化合物大都是由聚酮合酶或非核糖体肽合成酶等多酶复合体顺序催化下,经过连续的缩合反应合成的聚酮或聚肽类化合物。虽然这些化合物都来源于简单的小分子羧酸或氨基酸,但他们(包括来源于PKS、NRPS和PKS-NRPS杂合基因簇的化合物)都具有惊人的结构多样性。这些复杂的结构和立体化学多样性严重限制了化学合成的有效产量,因此微生物发酵一直作为主要生产细菌活性产物的经济路线。但是微生物发酵经常受到原始生产菌株的生长速度、培养条件、化合物产量和遗传操作工具的获得等客观条件的制约。因此,利用先进的分子生物学技术,将次级代谢途径从原始生产菌株转移至合适宿主中异源生产预期的次级代谢产物逐渐成为微生物和微生物药物化学领域研究的热点。来源于荧光假单胞菌Pf-5(Pseudomonas fluorescens pf-5)的rhizoxin化合物是一类大环内酯类抗生素,它能够和宿主细胞的p-微管蛋白相结合,抑制微管蛋白的聚合,引发细胞凋亡。由于该化合物展现出极好的抗真菌、抗肿瘤活性,吸引大批的研究学者对其进行深入研究,并一度作为潜在的抗肿瘤候选药物进入临床试验Ⅱ期。本研究,利用Red/ET同源重组技术从荧光假单胞菌Pf-5基因组中直接克隆rhizoxin生物合成基因簇,在该基因簇中插入转座元件和接合起始位点,以及更换强启动子,并将该表达载体通过接合转移分别整合至恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和荚壳伯克氏菌(Burkholderia glumae)基因组中,通过HPLC-MS检测到rhizoxin基因簇在异源宿主中的表达,但化合物的产量比原始菌株分别降低1.4倍和1.8倍。随后对一系列的rhizoxin衍生化合物进行了进一步的鉴定并探讨了发酵温度、发酵时间及宿主菌的分泌功能对rhizoxin衍生化合物产量的影响。来源于粘细菌Cystobacter sp. SBCb004的tubulysins化合物是一类具有细胞毒性的家族天然化合物(包含tubulysins A-Z等成员),能有效干扰微管蛋白的聚合,引发细胞的凋亡。比常用药物长春碱、紫杉醇和埃博霉素等显示了更好的抗肿瘤活性,而且此化合物还具有抑制血管新生的作用,很有希望成为新一代抗癌候选药物。本研究的主要工作集中在tubulysin生物合成基因簇的后期修饰及其异源表达上。在tubulysin核心生物合成基因tubB-tubF中,tubC的起始密码子为TTG。由于TTG在多数异源宿主中并不常用。为了确定ATG和TTG在tubulysin生物合成上的具体差异,将tubC起始密码子分别为ATG和TTG的完整的tubulysin表达构建分别整合至恶臭假单胞菌KT2440基因组中,通过HPLC-MS检测到tubulysin基因簇在异源宿主中的表达,但表达产物是tubulysin家族化合物的前体-Pretubulysin。随后,我们又将粘细菌Cystobacter sp. SBCb004中的氧化酶基因633P1(p450氧化酶)通过Red/ET重组技术插入到tubulysin表达构建中(Tub-ATG),并通过接合转移整合至恶臭假单胞菌KT2440基因组中,以期能够表达tubulysin化合物。尽管没有检测到tubulysin化合物的表达(仍旧表达pretubulysin),但为功能基因的研究奠定了坚实的基础。本研究还利用错误倾向PCR、交错延伸改组同时结合Red/ET重组技术成功构建了来源于苏云金芽胞杆菌4.0718的杀虫毒素Cry1Ac的基因文库,通过生物检测筛选到一株毒素变种T524N,该变种对甜菜夜蛾的杀虫活性是毒素基因cry1Ac突变前的1.46倍,而且仍能保持对棉铃虫的杀虫活性。并利用分子模型分析了变种T524N杀虫活性得到提高的原因。同时我们将Red/ET重组技术和DNA改组相结合开拓了一种改组大基因的新方法。通常情况下,DNA改组的基因大小不能超过3kb,对于大基因而言,我们可以分段改组,每一段都不大于3kb,然后利用Red/ET重组技术将这些改组的片段无缝的连接起来从而得到改组后的大基因。