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研究背景:G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor,GPCRs）是最大的一类膜受体,参与了生物体内许多重要的生理过程,能够将细胞外刺激转化为细胞内信号,是重要的药物靶点。苦味受体（bitter taste receptors,Tas2rs）属于GPCRs家族,最初在味蕾细胞中被发现,介导了机体对苦味的感知。近期研究表明,Tas2rs在口腔外组织,如血管平滑肌、气道、胃肠道等均有表达并介导特定生理功能。课题组前期研究结果和相关文献表明,血管平滑肌中Tas2rs的激活会引起血管舒张。除了平滑肌细胞,内皮细胞在调节血管舒缩中也扮演了重要的角色,但Tas2rs在内皮细胞中的表达及介导的信号通路并未明确。因此,本课题旨在研究Tas2rs在大鼠主动脉内皮细胞中的表达,并初步阐明内皮细胞中Tas2rs介导大鼠胸主动脉舒张的机制。这将为开发新的降压药物和新的降压靶点提供有力的理论依据,对心血管疾病的治疗具有深远意义。研究目标:1、明确大鼠主动脉内皮细胞中Tas2rs的表达。2、阐明内皮细胞中Tas2rs介导大鼠胸主动脉舒张的作用机制。研究方法:1、分离大鼠主动脉内皮细胞,利用q PCR、免疫荧光和免疫印迹等方法检测内皮细胞中Tas2rs及相关G蛋白的m RNA和蛋白表达。2、根据Tas2rs表达结果选择相应的Tas2rs激动剂（奎宁和地芬尼多）,利用离体组织浴槽系统,探究其对大鼠完整胸主动脉和去内皮胸主动脉的作用。3、利用内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,e NOS）抑制剂、可溶性鸟苷酸环化酶（soluble guanylyl cyclase,s GC）抑制剂和前列腺素I2（prostaglandin I2,PGI2）抑制剂探究奎宁和地芬尼多在内皮细胞中的信号通路;利用免疫荧光实验,检测奎宁和地芬尼多对内皮细胞内总e NOS及磷酸化e NOS水平的影响;利用激光共聚焦系统,探究奎宁和地芬尼多对内皮细胞内Ca2+水平的影响。4、使用Tas2rs拮抗剂、Tas2rs下游信号Gβγ和PLC的抑制剂研究Tas2rs信号通路的激活对大鼠胸主动脉舒张的影响。5、通过无创血压计检测奎宁和地芬尼多对大鼠收缩压、舒张压和平均压的影响,以探究两者对血压的调节能力。研究结果:1.在大鼠主动脉内皮细胞中检测到Tas2r38、39、103、108、113、114、135、137、140、143、Gnb1和Gnb3的m RNA表达,以及Tas2r108和137的蛋白表达。上述结果表明,在内皮细胞中可能存在Tas2rs介导的信号通路。2.地芬尼多（1～1000μM）可舒张L-苯肾上腺素（10μM）或KCl（60 m M）预收缩的大鼠完整胸主动脉环,p EC50分别是4.23±0.07和4.69±0.02,这表明地芬尼多具有舒张血管的潜力。3.去除胸主动脉内皮细胞后,奎宁（100μM）和地芬尼多（300μM）的舒张作用显著减弱（P＜0.05）,这表明奎宁和地芬尼多在L-苯肾上腺素（10μM）预收缩主动脉环上诱导的舒张作用部分依赖于内皮细胞完整性。4.预孵育e NOS抑制剂NG-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME,100μM）后奎宁（100μM）和地芬尼多（300μM）在预收缩大鼠胸主动脉环中的舒张作用被显著抑制（P＜0.05）;e NOS Ser1177位的磷酸化能增加e NOS活性,用奎宁或地芬尼多处理内皮细胞后,细胞中p-e NOS(Ser1177)的平均荧光信号从47.65±3.98 a.u.分别上调至74.68±9.91 a.u.和90.83±8.64 a.u.（P＜0.05）。s GC抑制剂亚甲基蓝（10μM）或1H-[1,2,4]恶二唑并[4,3-a]喹喔啉-1-酮（ODQ,10μM）均能显著抑制奎宁（100μM）和地芬尼多（300μM）在预收缩大鼠胸主动脉环中的舒张作用（P＜0.05）。上述结果表明这两种药物的舒张作用依赖于e NOS-s GC激活。5.奎宁和地芬尼多（500μM、1000μM）均能引起内皮细胞内Ca2+水平升高（P＜0.05）。e NOS的激活与Ca2+浓度有关,这表明奎宁和地芬尼多可能通过增加细胞内Ca2+使e NOS激活。6.预孵育PGI2拮抗剂吲哚美辛（10μM）不能抑制奎宁（100μM）和地芬尼多（300μM）对L-苯肾上腺素（10μM）或KCl（60 m M）预收缩大鼠完整胸主动脉环的舒张作用（P＞0.05）,这表明奎宁和地芬尼多的舒张作用与PGI2信号通路无关。7.在L-苯肾上腺素（10μM）预收缩的完整胸主动脉环中,Tas2rs拮抗剂Nα,Nα-bis（carboxymethyl）-L-lysin（BCML,50μM）能部分抑制奎宁（100μM）诱导的舒张作用（P＜0.05）;Tas2rs下游信号Gβγ的抑制剂茜素紫（75μM）和PLC的抑制剂U73122（10μM）均能使奎宁（1～1000μM）的浓度效应曲线右移;茜素紫和U73122也能阻断单浓度奎宁（100μM）的舒张作用（P＜0.05）。同样,地芬尼多（300μM）对大鼠胸主动脉的舒张作用也能被茜素紫和U73122部分抑制（P＜0.05）。然而,在去内皮胸主动脉环中,茜素紫和U73122对奎宁的舒张作用无影响（P＞0.05）。这表明奎宁和地芬尼多的舒张作用依赖于内皮细胞中Tas2rs-Gβγ-PLC信号通路的激活。8.腹腔注射奎宁（50 mg/kg,100 mg/kg）或地芬尼多（50 mg/kg）均能显著降低大鼠血压,这表明奎宁和地芬尼多都具有降低大鼠血压的潜力。结论:本课题初步阐明了大鼠主动脉内皮细胞中Tas2rs的表达及其介导的胸主动脉舒张机制:Tas2rs-Gβγ-PLC信号通路的激活使内皮细胞内Ca2+水平升高,从而激活e NOS,引起平滑肌细胞中s GC活化,最终导致血管舒张,课题为以苦味化合物为配体库筛选新的降血压药物提供了可靠的理论支持,为新降压靶点开发奠定基础。