全球每年大约有200万人罹患自发性脑内出血(spontaneous cerebral hemorrhage,ICH),具有死亡率和致残率高的特点,并且目前治疗措施效果不佳。因此,寻找脑出血治疗的新策略和新靶点具有重要的科学意义和临床价值。所谓化学遗传学技术(designer receptors exclusively activated by designer drugs,DREADDs),是利用遗传学方法,利用化学小分子作为工具解决生物的问题,或者通过干扰、调控正常生理过程,以达到了解蛋白质功能,是利用化学工具进行探索和研究生命过程的一门新兴学科。相关研究表明,刺激大脑皮层可能会促进脑卒中的康复,但是相关的机制目前尚不明确,在本文中,我们将利用腺相关病毒转染使小鼠运动皮层表达hM3D(Gq),并结合腹腔注射氯氮平-N-氧化物(CNO),进而特异性激活运动皮层中的谷氨酸能神经元,探讨运动皮层的谷氨酸能神经元在脑出血小鼠的恢复过程中的作用及可能机制。本论文开展的研究如下:首先,本文将能够靶向谷氨酸能神经元的腺相关病毒载体,利用立体定向技术构建化学遗传学小鼠动物模型。饲养3周待病毒载体稳定表达后,给予氯氮平-N-氧化物(CNO)腹腔注射以实现对动物皮层谷氨酸能神经元活性的调节。选取部分模型动物灌注、取材进行免疫荧光检测,验证化学遗传学病毒载体的神经元表达情况,并通过免疫组化技术检测模型动物中标识细胞激活的即早基因c-Fos基因的表达情况,以验证谷氨酸能神经元的化学遗传学激活。随后通过尾动脉血纹状体立体定向注射构建小鼠脑出血动物模型,并对模型的稳定性和成功率进行评估。表明大脑皮层靶向注射腺相关病毒包装的hM3Dq-mCherry工具联合腹腔注射氯氮平-N-氧化物能够化学遗传学激活皮层谷氨酸能神经元;同时,本研究通过自体尾动脉血定向纹状体注射建立的小鼠脑出血模型具有模型成功率高、小鼠存活率高、血肿体积相对固定、组内差异小的特点,能够良好地用于开展脑出血相关研究。进一步,对于化学遗传技术激活皮层谷氨酸能神经元脑出血小鼠,我们通过Longa神经缺失量表评估小鼠神经功能,利用Grip tese、悬吊实验和Rotating beam实验评估小鼠运动感觉功能的恢复情况。并利用Morris水迷宫实验评估小鼠认知功能的恢复情况。实验表明化学遗传学技术激活运动皮层谷氨酸能神经元可促进脑出血后整体神经状态、运动感觉功能、协调性和运动耐力的恢复,并促进脑出血导致的小鼠空间学习和记忆功能损害的恢复。为了更深入探讨化学遗传学技术激活皮层谷氨酸能神经元改善脑出血小鼠运动和认知功能,本文通过检测线粒体功能和海马齿状回(DG区)细胞增殖情况探讨谷氨酸能神经元激活改善神经功能恢复的内在机制。首先,制备模型动物的神经元单细胞悬液,通过流式细胞仪检测线粒体膜电位、ELISA方法检测线粒体ATP水平和DNA氧化损伤生物标记物8-羟基脱氧尿苷(8-OHdG)的含量,揭示皮层谷氨酸能神经元对线粒体功能的影响;然后,通过5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记,免疫组织化学法,检测海马齿状回(DG)区细胞增殖情况,明确皮层谷氨酸能神经元的激活促进脑出血小鼠认知功能内在机制。实验结果表明运动皮层谷氨酸能神经元激活可以改善线粒体膜电位,提高ATP水平,缓解DNA氧化损伤,改善线粒体功能,会促进小鼠脑出血后功能恢复;针对海马齿状回新生神经元的5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记进行检测,发现海马DG区BrdU+神经元数明显升高,表明皮层谷氨酸能神经元激活后该区神经元增殖能力增强,促进脑出血后小鼠认知功能的恢复。综上所述,本文利用化学遗传学技术靶向激活运动皮层谷氨酸能神经元,通过其突触联系和纤维投射,明显促进脑出血后神经元的线粒体功能改善和海马DG区细胞增殖,有利于运动和认知功能障碍的改善。本研究揭示了运动皮层的谷氨酸能神经元激活可能是潜在的对脑出血后神经功能障碍进行靶向干预的新途径,并为药物研发及临床精准治疗脑出血导致的血肿灶周白质损伤导致的运动、感觉及认知功能障碍提供新的手段或策略。第一部分 构建hM3Dq-mCherry稳定表达的小鼠运动皮层谷氨酸能神经元激活动物模型及其生物学特征验证1.目的:构建化学遗传学技术激活运动皮层谷氨酸能神经元的动物模型,进行腺相关病毒转染并激活神经元的生物学验证。2.方法(1)本部分实验,将动物分为以下四组:Sham(假手术)组、hM3Dq组(pAAV2/9-CaMKⅡ α-hM3Dq-mCherry+ICH 模型)、mCherry 组(pAAV2/9-CaMKⅡ α-mCherry+ICH模型)和ICH组(脑出血模型对照组)。在ICH小鼠模型构建3周前,利用脑立体定向注射技术按照不同分组向小鼠右侧运动皮层M1 区两个靶点注射实验真病毒pAAV2/9-CaMKⅡ α-hM3Dq-mCherry(hM3Dq 组)和对照假病毒pAAV2/9-CaMKⅡ α-mCherry(mCherry 组)。共 220 只成年小鼠称取体重随机分组,每组55只动物,另外取30只乳鼠(出生15-17天)按不同分组分别注射 pAAV2/9-CaMKⅡ α-hM3Dq-mCherry、溶剂 Vehicle 和pAAV2/9-CaMKⅡ α-mCherry用于运动皮层化学遗传学转染的鉴定。病毒注射后3周建立ICH小鼠模型,并在建模后7天开始腹腔注射CNO(7 p.m.),连续注射21天。(2)在AAV病毒注射3周后,将乳鼠主动脉灌注,收集乳鼠脑组织制作脑片,利用荧光显微镜观察乳鼠大脑运动皮层mCherry的荧光表达,利用免疫荧光染色检测CaMKⅡα 阳性谷氨酸能神经元的病毒表达情况。(3)待乳鼠给予连续腹腔注射CNO后1周,升主动脉灌注、取材,免疫组化检测乳鼠大脑运动皮层c-Fos的表达,以验证运动皮层谷氨酸能神经元的化学遗传学激活情况。3.结果(1)病毒表达情况:病毒注射3周后,荧光显微镜激光激发后显示,运动皮层M1区出现红色荧光,表明工具病毒在运动皮层表达。DAPI细胞核染色结果显示运动皮层M1区谷氨酸能神经元细胞中同时DAPI和mCherry 荧光蛋白,表明 pAAV2/9-CaMKⅡα-hM3Dq-mCherry 转染了谷氨酸能神经元,并稳定表达。(2)即早基因c-Fos的免疫组化检测:CNO腹腔注射1周后,灌注、取材,针对表达hM3Dq-mCherry神经元的代表性组织切片的免疫组化显示c-Fos在联合CNO应用之后出现明显的阳性表达水平升高,说明CNO能够化学调整谷氨酸能神经元活性,并引起谷氨酸能神经元兴奋性升高。4.结论:脑立体定位注射腺相关病毒包装的化学遗传学工具pAAV2/9-CaMKⅡα-hM3D(Gq)-mCherry 和 pAAV2/9-CaMKⅡα-mCherry 联合腹腔注射CNO能够转染运动皮层谷氨酸能神经元,而且前者能够调控谷氨酸能神经元的兴奋性。第二部分 化学遗传学激活运动皮层谷氨酸能神经元对脑出血小鼠运动和认知功能的影响(一)自体尾动脉血立体定向靶向注射纹状体构建脑出血动物模型1.目的:建立脑出血小鼠动物模型,并对脑出血模型的稳定性、成功率进行评价。2.方法(1)脑立体定向注射技术构建脑出血动物模型:取体重为25-30 g的C57BL/6小鼠(分组如前)。所有小鼠经5%异氟烷诱导麻醉后,气管插管并2-3%异氟烷维持麻醉进行手术。采用尾动脉血立体定向纹状体注射法构建小鼠ICH模型。术前8h禁食,4h禁水,麻醉成功后,俯卧位固定于小动物脑立体定向手术台上(512600,Stoelting,USA)。剃除小鼠颅骨表面毛发,使用碘伏消毒并75%酒精脱碘后,剪开头皮(为促进术后恢复,皮肤切开尽量短),骨膜用骨膜剥离器剥离,暴露前囟及冠状缝,少量3%双氧水擦拭,剪去残留的受损组织。立体定向仪调整前囟和后囟高度,保证两者处于同一水平面。根据小鼠脑解剖图谱,以前囟为原点,对靶向运动皮层进行定位(AP=0.00 mm,ML=+2.2 mm,DV=-2.5 mm)。定位后,用牙科钻钻孔至脑膜。用恒温电热垫加温鼠尾,使用乙醇消毒即见充血,距尾端2cm处切断鼠尾,微量注射器抽取非抗凝血50uL,将注射器固定于立体定向仪上,通过微量进样泵将注射器中的尾动脉血缓慢注射(15uL/5min匀速注入),注射结束后留针5min,然后退针2.0mm停针4min,最后将注射器缓慢退出。注射期间酒精棉球包扎鼠尾断端,术后以骨蜡封闭颅骨骨孔,碘伏消毒,无菌缝线缝合头皮涂抹红霉素软膏预防感染。Sham组没有尾动脉立体定向注射纹状体外,手术过程的麻醉方式和手术操作均同于其余组别。(2)动物脑出血模型评价:分别于脑出血模型构建手术处理后2小时和24小时,用Longa评分量表分别评定各实验分组小鼠的神经缺失情况。小鼠体重损失超过20%及神经功能评分同正常对照组存在统计学差异则排除于后续实验。3.结果(1)存活率:手术2小时后sham组小鼠的存活率为100%,hM3Dq组小鼠的存活率为94.55%,ICH模型组小鼠的存活率为98.18%,mCherry组小鼠的存活率为96.36%。手术24小时后Sham组小鼠的存活率为100%,hM3Dq组小鼠的存活率为92.73%,ICH模型组小鼠的存活率为96.36%,mCherry组小鼠的存活率为94.55%。(2)术后2小时开始进行神经缺失评分,ICH组中神经缺失评分为1-3分的小鼠占76%,hM3Dq组神经缺失评分为1-3分的小鼠占77%,mCherry组神经缺失评分为1-3分的小鼠占76%;术后24小时ICH组中神经缺失评分为1-3分的小鼠占66%,hM3Dq组神经缺失评分为1-3分的小鼠占65%,mCherry组神经缺失评分为1-3分的小鼠占63%。结论:通过自体尾动脉血立体定向纹状体注射建立的小鼠脑出血模型具有模型成功率高、小鼠存活率高、血肿体积相对固定、组内差异小的特点,是开展脑出血相关研究的良好模型。(二)评估运动皮层谷氨酸能神经元激活对脑出血小鼠运动和认知功能恢复的影响1.目的:本部分实验将在激活皮层谷氨酸能神经元的基础上构建脑出血模型后,进一步探讨化学遗传学技术刺激运动皮层谷氨酸能神经元对脑出血小鼠运动和认知功能的影响。2.方法:本部分研究实验分组如前。脑出血模型构建实验后1周开始对各个实验分组氯氮平-N-氧化物(CNO,3mg/kg)腹腔连续注射。分别于CNO连续腹腔注射的第7天和第21天时,在末次CNO腹腔注射的6小时内进行运动感觉和认知功能的神经学评估。利用Longa神经缺失量表评估受试小鼠总体神经功能,转棒试验、Grip test和悬吊实验评定小鼠运动功能,使用Morris水迷宫实验评估小鼠的认知功能恢复情况。3.结果(1)神经功能缺损和运动功能的恢复:Longa神经缺失量表评定结果表明hM3Dq、ICH、和mCherry组的神经功能缺损评分高于Sham组,具有显著性差异(P=0.031,P<0.0001,P=0.0002);ICH组和mCherry组的神经功能缺损评分高于hM3Dq组(P=0.0086,P=0.0228);ICH组的神经功能缺损评分同mCherry组无显著差异(P>0.05)。转棒试验结果显示,从CNO干预第7天开始,hM3Dq组的运动距离和运动速度均显著高于mCherry组和ICH组(均P＜0.05),但低于Sham组评分(P＜0.05)(表2.4和图2.5)。悬吊实验显示,hM3Dq组、ICH组和mCherry组的评分显著低于Sham组(P＜0.0001),ICH组和mCherry组的评分低于hM3Dq组(P＜0.001),ICH组和mCherry组的评分无显著差异(P＞0.05)。(2)皮层谷氨酸能神经元激活对记忆功能的影响:Morris水迷宫实验结果表明,hM3Dq组逃避潜伏期低于其他模型对照组(P＜0.05),游泳速度明显快于其他模型对照组(P＜0.05);在探索试验中,将平台移除,hM3Dq组与ICH和mCherry组小鼠在目标象限中花费的时间有显著性差异(P=0.0123,P=0.0112),两对照组之间无显著差异(P＞0.05);对位训练中,hM3Dq组与ICH和mCherry两个对照组比较,小鼠穿越平台位置数量显著增加(P=0.0341,P=0.0177),对照组之间穿越平台位置数无显著差异(P=0.6433)。4.结论:化学遗传学技术激活运动皮层谷氨酸能神经元可促进脑出血后整体神经状态、运动功能、协调性和耐力的恢复,进而促进脑出血所导致的小鼠空间学习和记忆损害的恢复。第三部分 化学遗传学激活运动皮层谷氨酸能神经元改善脑出血小鼠运动和认知功能恢复的线粒体相关机制研究1.目的:检测化学遗传学技术激活运动皮层谷氨酸能神经元对脑出血小鼠线粒体功能的影响。2.方法(1)流式细胞仪检测线粒体膜电位:实验动物颈椎脱臼处死,冰盒内后续操作。75%酒精浸泡1-3分钟后置于超净工作台内,无菌取大脑。将模型灶周脑组织用小剪刀剪碎,转移至放离心管,加入0.25%胰-EDTA复合消化液置于37℃孵育箱中消化20-30min,消化期间间断震荡和吹打。用预冷NeurobasalTM神经元专用培养基终止消化,吸管轻柔吹打均匀后,静置,取上清液放400目细胞筛过滤,并收集细胞悬液。收集的上清液用吸管吹打均匀后离心(1000rpm,5min),弃去上清,反复冲洗1-2次后加预冷NeurobasalTM神经元专用培养基,制成模型小鼠神经元单细胞悬液。然后,细胞计数,调整细胞浓度。植入24孔板中,每组设4个平行样本,加入新鲜配置的TMRM线粒体染色液(30nM)移至细胞培养箱内,37℃避光孵育30min。预冷PBS清洗后流式细胞仪上机检测。取每组lx106个神经元荧光强度值的平均值作为该组测得值。其平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)又代表神经元细胞 MMP 水平。TMRM的激发波长为561nm、发射波长为581nm,使用CellQuestpro软件对结果进行分析。(2)线粒体ATP水平检测:将动物颈椎脱臼处死,置于冰盒75%酒精1-3分钟后移至超净工作台,无菌操作取大脑,剪取模型灶周小块重量约为50-100mg的脑组织。将每10mg脑组织在100 uL的ATP Assay缓冲液研磨10次,使用10kDa MWCO超滤离心管去除蛋白。将ATP Assay Kit(Sigma,MAK1901KT)试剂置于冰浴中溶解后,用90mL的水稀释10mL 10mM(10 nmole/mL)的 ATP 标准溶液,生成 1mM(1nmole/mL)的ATP标准溶液。向96孔板中加入0、2、4、6、8和10 uL的1 mM ATP标准溶液,配置浓度分别为0(空白)、2、4、6、8和10 nmol/1标准溶液;加入ATP Assay缓冲液,使每孔体积达到50uL。按照产品说明书将ATP Assay 缓冲液、ATP Probe、ATP Converter、Developer Mix 按照固定比例配置反应混合物,96孔板中上样,每孔50uL。在Sample Blank中省略ATP Converter,以校正样品中的背景。为确保读数在标准曲线的线性范围内,每样品上样3个复孔。将50 uL的适当反应混合物添加到每个孔中。用水平振动筛或移液管充分搅拌。在室温下孵育30分钟后在570nm(A570)测量吸光度。制备标准曲线,其中纵坐标代表RLU值,横坐标代表ATP浓度。(3)线粒体DNA氧化产物8-羟基脱氧鸟苷酸(8-OHdG)检测:将动物颈椎脱臼处死,冰盒内用75%酒精浸泡1-3分钟后置于超净工作台,无菌操作取大脑,剪取模型侧重量约为50-100mg的脑组织液氮速冻。以每克组织加入5mL匀浆缓冲液配比(0.1 M PBS,pH值7.4,含1 m M EDTA)使用超声波仪均质样品,在1000 x g下离心10 min,并使用DNA提取试剂盒(abcam,KIT0103)纯化上清液,核酸酶P1(Sigma-Aldrich,N8630-1VL)消化 DNA,1 M Tris 调整 pH 值到 7.5-8.5,每 100μg DNA加入1单位碱性磷酸酶(Sigma,P7640),37℃孵育30 min,煮10 min,置于冰上备用。将8-OHdG ELISA试剂盒(Abcam,ab201734)复温至室温(20-25℃),使用超纯水将Wash Buffer(1:10)和8-羟基-2-脱氧鸟苷:HRP结合单克隆抗体(1:100)的储存液稀释,制备工作液。按照ELISA指南配置标准液至终浓度为0(空白)、0.94、1.875、3.75、7.5、15、30、60 ng/mL,然后使用多通道移液器将标准液和样品液各50uL加入96孔板,并加入50uL 8-OHdG准备液(空白孔除外),向空白孔中加入标准/样品稀释液和抗体稀释液各50uL(各孔总容积为100uL),混匀后盖上96孔板并室温孵育1小时。使用1X洗涤缓冲液300uL充分洗涤96孔板共4次,再向每孔中加入100uL TMB底物并盖上第2个孔板盖,孵育30min后加入终止缓冲液100uL,酶标仪450nm波长读取吸光度值。制备标准曲线后计算获得各实验组8-OHdG数值,进行统计学数据分析。3.结果(1)皮层谷氨酸能神经元激活改善线粒体膜电位:流式细胞仪的荧光图谱显示脑出血(ICH)组比假手术组(Sham)荧光强度大的神经元细胞比率减少,说明脑出血损伤致线粒体膜电位下降(P＜0.0001);hM3Dq组的荧光强度大的神经元细胞比率高于ICH组(P＜0.0005);mCherry组荧光强度大的细胞比率同ICH组比较无显著差异(P＞0.05)。说明运动皮层谷氨酸能神经元激活减轻了脑出血对线粒体膜电位的损伤程度。(2)皮层谷氨酸能神经元激活上调细胞ATP水平:研究发现,化学遗传学技术兴奋运动皮层谷氨酸能神经元后,与Sham组相比,ICH组脑内血肿周边组织内ATP含量明显降低(P＜0.0001),表明脑出血损伤了细胞ATP生成。同时,hM3Dq组同ICH组和mCherry组相比,具有显著差异(P＜0.0001)。该结果明确提示,化学遗传学技术兴奋谷氨酸能神经元可上调细胞内ATP水平,提示谷氨酸能神经元兴奋与能量生成存在偶联。(3)谷氨酸能神经元激活抑制DNA氧化损伤:本研究表明,ICH组脑组织内8-OHdG含量明显高于Sham假手术组,并且具有显著性差异(P=0.0012),表明脑出血后氧化损伤明显增加,导致其中氧化损伤产物8-OH-dG升高;hM3Dq组的脑组织8-OHdG含量明显低于ICH组,并且具有显著性差异(P=0.0032),表明运动皮层谷氨酸能神经元激活后,脑出血导致的氧化损伤得到明显的改善,其氧化损伤的产物8-OHdG下降;mCherry组中受试动物脑组织的8-OHdG含量同ICH组比较,无显著差异(P>0.05)。以上结果表明表明激活运动皮层谷氨酸能神经元,脑出血后自由基生成减少,减轻了 DNA氧化损伤。4.结论线粒体作为细胞的“能量工厂”,为细胞生物活动提供了绝大部分的ATP能量来源。而线粒体的正常功能又直接依赖着线粒体膜电位水平的正常。在细胞活力正常的情况下,线粒体膜电位处于正常高位,能够很好地为细胞提供各种生理活动所必需的能量。在细胞趋近于凋亡时最明显的特点就是往往伴随着线粒体膜电位的降低,线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的标志性事件之一。通过我们得到的关于脑出血后病灶周围组织在运动皮层谷氨酸能神经元不同兴奋性条件下ATP水平、线粒体膜电位、DNA氧化损伤产物8-OHdG等指标的变化趋势,我们可以确定大脑运动皮质谷氨酸能神经元激活具有维护线粒体正常功能的趋势,从而改善脑出血后小鼠的运动和认知功能。第四部分 化学遗传学激活运动皮层谷氨酸能神经元改善脑出血小鼠运动和认知功能恢复的海马DG区细胞增殖相关机制研究1.目的:揭示化学遗传学技术激活运动皮层谷氨酸能神经元促进脑出血小鼠认知功能改善的海马齿状回细胞增殖相关机制。2.方法海马齿状回(DG区)细胞增殖检测:实验各组小鼠腹腔注射CNO 21天后给予BrdU溶液(给药剂量为50mg/kg)腹腔注射,每天给药2次,给药间隔12小时,连续给药2天。在给药7d后采用氯胺酮和二甲苯嗪腹腔注射麻醉(氯胺酮100mg/kg,二甲苯嗪25mg/kg),待角膜反射和肌张力消失后,给予4℃预冷4%多聚甲醛溶液(50mL 0.9%生理盐水预冲洗,然后250mL 4%多聚甲醛前固定,先快后慢)经左心室升主动脉灌注固定脑组织,冰盒内完整取出小鼠脑,保留海马部位,震动切片机上连续冠状切片,脑片厚度为40μm,每切5张选取1张,每个样本共收集12张,置于PBS待行BrdU免疫组化检测。将切片置于50%甲酰胺溶液中65℃水浴 2h,PBS(PH=7.4)洗片,2M 盐酸中 37℃孵育 30min,0.1M硼酸洗片10 min,PBS洗片后用30%H2O2室温孵育半小时,PBS洗片,血清封闭后室温孵育60min,弃血清洗片后加入BrdU一抗(1:1000),4℃孵育24h,弃一抗并PBS洗片,加入生物素标记二抗(稀释度为1:100),室温孵育30min,PBS洗片后再以ABC试剂室温孵育半小时,PBS洗片后DAB试剂显色,待染色满意后用ddH2O漂洗切片终止染色。将染好的切片平展贴于载玻片,晾干后中性树胶封片,指甲油固定。3.结果研究表明,ICH组脑出血后的海马DG区BrdU+细胞数低于Sham组,差异具有统计学意义(P＜0.05),表明脑出血损伤了海马DG区的细胞增殖能力;hM3Dq组海马DG区BrdU+细胞数明显高于ICH组,并且具有显著性差异(P＜0.01),表明运动皮层谷氨酸能神经元的激活,促进了海马DG区神经元的细胞增殖能力;ICH组同mCherry组比较,BrdU+细胞数量的差异没有统计学意义(P＞0.05)。通过以上结果,可以认为运动皮层M1区谷氨酸能神经元激活,可能促进了海马DG区细胞的增殖能力。4.结论通过化学遗传学方法激活运动皮层谷氨酸能神经元总体上促进了海马DG区神经元的细胞增殖能力,从而促进了脑出血小鼠的认知功能的改善。