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钙离子作为重要的细胞内信使,参与的信号转导过程在植物生长发育过程中中起到重要的调节作用。真核细胞中含有多种钙离子效应蛋白,通过改变细胞内钙离子水平调节细胞的生理活动。膜联蛋白(Annexin)属于其中一类钙离子效应蛋白,它们以钙离子依赖方式结合某些细胞膜磷脂,介导钙离子信号与膜之间的信号转导。已知Annexin参与动物的多种细胞过程,如膜转运,离子运输,有丝分裂,细胞骨架重排及DNA折叠等。Annexin在植物中广泛存在,但对其确切功能了解较少。
本研究对拟南芥Annexin家族成员的基因表达、蛋白的亚细胞定位和AnnAt3的功能等进行了初步分析,主要结果为:
(1)该基因家族成员在拟南芥不同的发育阶段、不同组织器官中表达。其中AnnAt1、AnnAt6、AnnAt7在幼苗、花和种子中都有表达;AnnAt2、AnnAt3、AnnAt4、AnnAt5、AnnAt8的表达具有较高的时空和组织特异性。AnnAt2主要在子叶、胚轴和花萼中表达;AnnAt3主要在叶片、幼苗下胚轴和花萼中表达;AnnAt4只在幼苗下胚轴表达;AnnAt5主要在幼苗胚轴和花丝中表达;AnnAt8在叶片、花萼和种子中表达。AnnAt3、AnnAt6、AnnAt7、AnnAt8在保卫细胞中表达。
(2)通过在烟草中进行瞬时表达和在拟南芥中进行稳定表达GFP融合蛋白,分析了部分Annexin部分成员的亚细胞定位。结果显示AnnAt2、AnnAt3和AnnAt6定位于细胞质和细胞核;AnnAt5定位于过氧化物酶体;AnnAt7定位于细胞质。这些结果暗示Annexin的成员在不同的细胞生理过程中起作用。
(3)利用qRT-PCR、GUS组织染色等方法,分析了AnnAt3对非生物胁迫的响应。野生型拟南芥幼苗经150mmol/LNaCl处理6h和12h、0.5μmol/LMV处理3h和6h后,AnnAt3的基因表达都明显提高。转基因AnnAt3promoter:GUS拟南芥幼苗经50μmol/L MV、100mmol/LNaCl、150mmol/L甘露醇和0.1mmol/LABA处理3h后,GUS染色结果显示该基因表达量升高的部位主要位于根部。在分别含有100mMNaCl和0.6μMABA的MS培养基上生长14d后,结果发现超表达转基因拟南芥的幼苗根系明显短于野生型拟南芥。说明该基因响应非生物胁迫可能与激素ABA有关。
(4)观察GFP-ABD2-GFP标记的annAt2和annAt3突变体的微丝骨架,发现突变体幼苗下胚轴细胞质膜内侧的微丝数量较野生型明显减少,微丝动态发生改变,表明拟南芥AnnAt2、AnnAt3可能参与调节细胞微丝骨架的动态。
本研究通过细胞和分子生物学的方法,对拟南芥Annexin家族基因的时空表达、部分成员蛋白的亚细胞定位进行了分析,同时对AnnAt3对非生物胁迫的响应及其参与调控微丝骨架动态进行了初步的研究,为进一步在分子水平上研究拟南芥Annexin的功能和作用机制奠定了基础。