目的:构建针对艰难梭菌主要毒力因子tcdB基因的CRISPR系统并对其进行切割,特异性抑制产毒艰难梭菌的生长。方法:在线设计针对tcdB的sgRNA,分别将sgRNA与Cas9单独或共同作用于tcdB基因扩增产物,验证体外切割效能;用穿膜肽连接sgRNA和Cas9以提高递送效率,将CPP-sgRNA、CPP-Cas9、CPP、CPP-sgRNA+CPP-Cas9、sgRNA+CPP-Cas9分别作用于产毒艰难梭菌,通过监测菌液OD600值和菌落计数,观察对细菌生长的抑制效果。用同样的方法处理肠道其他致病菌,进行特异性的验证。结果:sgRNA和Cas9形成的复合物可对tcdB扩增产物产生良好的切割效能,而单独的sgRNA或Cas9均无切割作用;与空白对照比较,单独加入CPP-sgRNA、CPP-Cas9、CPP对细菌生长没有影响;CPP-sgRNA与CPP-Cas9共同作用,无细菌生长;单独sgRNA与CPP-Cas9共同作用,细菌生长轻度受抑。用同样的方法将CPP-sgRNA+CPP-Cas9处理不产毒艰难梭菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌后,菌液OD600值和菌落计数与空白对照无差别。结论:本研究建立的针对tcdB的CRISPR系统在体外不仅可对tcdB基因进行高效切割,而且成功抑制了产毒艰难梭菌的生长;利用cpp作为递送载体,使sgRNA转染进入细菌的效率得到了很大提高。