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中国水仙（Narcissus tazetta var.chinensis）是一种重要的年宵花卉,具有较高观赏价值和经济价值。花发育机制研究是花卉发育研究中的重要课题之一。MADS-box基因在花发育中发挥着重要的调控作用。AGL6基因是MADS-box基因家族中的成员之一,调控花器官发育和成花诱导;TFL1基因是花序分生组织特征基因,参与植物成花诱导调控。中国水仙是典型的高温诱导成花植物,对其分子机制了解较少。本研究初步研究中国水仙AGL6类MADS-box基因NtAGL6的作用机制,并分析中国水仙Nt TFL1基因的功能,主要研究内容和结果如下:1.NtAGL6基因启动子的克隆和分析利用染色体步移法从中国水仙‘金盏银台’的基因组DNA中克隆得到NtAGL6起始密码子上游803 bp序列,其包含9个核心元件TATA-box和17个增强元件CAAT-box,也包含多个与发育调控及环境响应等相关的作用元件。将NtAGL6启动子序列替换植物表达载体p BI121中Ca MV35S启动子,成功构建了启动子表达载体pBI121-NtAGL6QDZ::GUS。在烟草叶片中瞬时表达结果显示NtAGL6启动子能启动报告基因的表达,具有启动子活性;高温和GA3诱导处理下均可增强GUS基因的表达。对中国水仙‘金盏银台’不同组织器官的瞬时表达研究结果表明该启动子在水仙的花瓣、雌蕊、副冠和鳞茎盘中均有表达。2.NtAGL6干扰表达载体构建及对中国水仙的遗传转化选取NtAGL6特异的约500bp序列,根据p TCK303酶切位点设计特异引物,PCR扩增后获得带有所需酶切位点的NtAGL6片段,分别将基因片段正反向连接于载体p TCK303中,构建干扰表达载体p TCK303-Ri NtAGL6。通过农杆菌介导法转化中国水仙‘金盏银台’和‘百叶’,获得抗性芽。3.中国水仙NtAGL6作用机制的初步分析利用In fusion技术构建了p HIS2-FT1Pro和p GADT7-AGL6载体,酵母单杂交结果显示NtAGL6并不直接结合在中国水仙Nt FT1启动子上。构建了p GADT7-NtAGL6、p GADT7-NtAP1、p GADT7-NtAG、p GADT7-NtAP3、p GADT7-Nt SOC1、p GADT7-Nt SVP、p GADT7-Nt FT1和p GBKT7-NtAGL6载体;分别将p GBKT7-NtAGL6和p GADT7-NtAGL6、p GADT7-NtAP1、p GADT7-NtAG、p GADT7-NtAP3、p GADT7-Nt SOC1、p GADT7-Nt SVP、p GADT7-Nt FT1两两转化酵母,结果显示NtAGL6能与NtAG1、Nt SOC1、Nt SVP、NtAP1、NtAP3互作,自身也能形成同源二聚体,不能与Nt FT1互作。构建表达载体p SAK277-Nt SOC1、p SAK277-NtAGL6和p GREENⅡ0800-FTQDZ-LUC,采用p GREENⅡ0800-FTQDZ-LUC载体进行双荧光素酶实验,发现分别加入Nt SOC1和NtAGL6能增强Nt FT1启动子的活性,但同时加入Nt SOC1和NtAGL6并没有进一步加强Nt FT1启动子的活性。4.中国水仙Nt TFL1基因的克隆及表达分析利用RT-PCR技术克隆了中国水仙TFL1基因Nt TFL1-1和Nt TFL1-2,对其生物信息学、亚细胞定位和表达模式进行了分析。结果表明Nt TFL1-1开放阅读框501 bp,编码166个氨基酸,Nt TFL1-2的开放阅读框525 bp,编码174个氨基酸;二者均具有TFL家族的保守结构域;Nt TFL1-1和Nt TFL1-2编码的蛋白均定位在细胞质中。Nt TFL1-1和Nt TFL1-2在水仙花芽分化初期和花序原基形成期的表达量较低,在花原基形成期表达量较高;Nt TFL1-1和Nt TFL1-2在根中的表达量显著高于茎、叶和成熟的花。