【摘 要】
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目的:探讨山奈酚（Kaempferol,KAE）在烟曲霉菌（Aspergullus fumigatus,A.fumigatus）性角膜炎中的抗菌和抗炎作用及其潜在机制。方法:（1）使用CCK-8试剂盒检测不同浓度的KAE对小鼠巨噬细胞RAW264.7和永生化的人角膜上皮细胞（human corneal epithelial cells,HCECs）是否有细胞毒性作用,并为后续实验浓度确定药用浓度;
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目的:探讨山奈酚（Kaempferol,KAE）在烟曲霉菌（Aspergullus fumigatus,A.fumigatus）性角膜炎中的抗菌和抗炎作用及其潜在机制。方法:（1）使用CCK-8试剂盒检测不同浓度的KAE对小鼠巨噬细胞RAW264.7和永生化的人角膜上皮细胞（human corneal epithelial cells,HCECs）是否有细胞毒性作用,并为后续实验浓度确定药用浓度;（2）建立C57BL/6小鼠烟曲霉菌性角膜炎模型,分别给予KAE和DMSO处理。在感染后第1、3天通过裂隙灯观察两组角膜炎症情况,进行临床炎症评分并拍照记录,并于感染后第3天取角膜行HE染色和平板菌落计数分别观察KAE对角膜组织炎症浸润和真菌负荷的影响;（3）使用免疫荧光法、MPO试剂盒检测KAE对真菌性角膜炎中巨噬细胞和中性粒细胞浸润的影响;（4）通过实时荧光定量PCR（q RT-PCR）评估感染后3天角膜中IL-1β、TNF-α、MIP-2以及模式识别受体TLR4、Dectin-1的m RNA表达水平,用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测检测IL-1β、TNF-α、MIP-2的蛋白表达水平,Western Blot检测TLR4、Dectin-1的蛋白表达和p38 MAPK蛋白磷酸化水平;（5）KAE预处理2小时后,使用灭活的烟曲霉菌菌丝刺激小鼠巨噬细胞,分别检测烟曲霉菌刺激8小时、24小时后IL-1β、TNF-α、MIP-2在m RNA和蛋白水平的表达情况,以及烟曲霉菌刺激1小时后的p38 MAPK蛋白磷酸化情况;（6）使用KAE预处理后,Dectin-1特异性激动剂Curdlan刺激RAW264.7细胞,再次检测分别刺激8小时、24小时后TNF-α和MIP-2的m RNA和蛋白水平表达情况,以及刺激1小时后的p38 MAPK磷酸化情况。结果:（1）KAE浓度低于60μg/m L时不影响HCECs的细胞活性,KAE浓度低于30μg/m L时不影响RAW264.7的细胞活性;（2）与DMSO对照组相比,60μg/m L KAE处理组的小鼠的烟曲霉菌性角膜炎病程进展明显变缓,感染后第3天临床评分和角膜真菌负荷均显著降低;（3）与DMSO相比,经过KAE处理的小鼠角膜在感染后3天水肿明显减轻,炎性细胞如中性粒细胞和巨噬细胞的浸润明显减少;（4）q RT-PCR、ELISA和Western Blot结果显示60μg/m L KAE下调了烟曲霉菌诱导的小鼠角膜炎中模式识别受体TLR-4、Dectin-1及炎症相关介质IL-1β、TNF-α、MIP-2的表达,同时减少了促炎通路p38 MAPK的磷酸化激活;（5）30μg/m L KAE下调烟曲霉菌诱导的小鼠巨噬细胞炎症模型中IL-1β、TNF-α、MIP-2的表达,抑制了通路p38 MAPK的磷酸化激活;（6）30μg/m L KAE下调Curdlan诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞炎症模型中TNF-α、MIP-2的表达,抑制了通路p38 MAPK的磷酸化激活。结论:KAE减少烟曲霉菌性角膜炎的小鼠角膜中的真菌负荷、减轻炎症过程中炎性细胞的募集以及减少炎症相关介质IL-1β、TNF-α、MIP-2的表达,从而在真菌性角膜炎中发挥保护作用;KAE的抗炎作用是通过发挥对模式识别受体Dectin-1和促炎通路p38 MAPK的抑制性调控来实现的。
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