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目的本研究旨在围绕前期研究中发现的存在于骨肉瘤的特异性新频发LRP1-SNRNP25融合基因,首先发现该融合基因在DNA水平上的结构和断裂位点,明确其形成机制,然后探讨LRP1-SNRNP25融合基因对骨肉瘤细胞的侵袭、迁移以及成瘤和远处转移能力的影响,之后寻找LRP1-SNRNP25融合基因下游的信号分子通路,明确LRP1-SNRNP25融合基因在骨肉瘤中发挥促侵袭和迁移作用的分子机制,为针对LRP1-SNRNP25融合基因的靶向治疗奠定基础,探索骨肉瘤中LRP1-SNRNP25靶向治疗新靶点。方法1.HiSeq X Ten平台对LRP1-SNRNP25融合基因阳性标本进行全基因组测序。针对已经检测到的LRP1-SNRNP25融合基因阳性的1例骨肉瘤样本,提取基因组DNA,采用HiSeq X Ten平台进行全基因组测序(WGS),结合生物信息学分析技术,明确LRP1-SNRNP25融合基因在DNA水平上的结构,并验证该融合基因的存在。2.探讨LRP1-SNRNP25融合基因过表达对骨肉瘤细胞的侵袭、迁移以及成瘤和远处转移能力影响。一方面,构建LRP1-SNRNP25质粒,购买LRP1和SNRNP25质粒,并通过质粒测序技术进行验证。在骨肉瘤细胞143B和SAOS2中瞬时转染LRP1-SNRNP25,LRP1,SNRNP25,以及空载体,G418筛选稳定表达细胞系,通过Western blot进行验证之后,通过细胞划痕实验以及Transwell实验检测LRP1-SNRNP25,LRP1,SNRNP25过表达后肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。另一方面,将稳定表达LRP1-SNRNP25以及空载体的慢病毒感染骨肉瘤细胞143B通过皮下种植接种至裸鼠大腿根侧,并定期观测肿瘤体积的变化,进一步使用免疫组织化学染色的方法检测LRP1-SNRNP25表达和定位情况(因为尚无针对LRP1-SNRNP25的抗体,所以使用Flag标签抗体进行检测),以及通过检测Ki-67的表达情况来评估LRP1-SNRNP25对骨肉瘤细胞在体内的增殖活跃程度的影响。同时,将稳定表达LRP1-SNRNP25以及空载体的慢病毒感染骨肉瘤细胞143B,通过尾静脉注射入裸鼠体内,之后将裸鼠统一处死,对其肺部和肝脏进行解剖,对其肺部和肝脏的结节进行计数并比较,并对肺部和肝脏进行组织包埋然后进行苏木精-伊红(HE)染色,以对结节的性质进行确认。3.探索LRP1-SNRNP25融合基因影响骨肉瘤细胞侵袭迁移的分子机制。首先使用Western blot对LRP1-SNRNP25,LRP1,SNRNP25,以及空载体过表达的骨肉瘤细胞143B和SAOS2细胞进行迁移和侵袭相关的信号通路及分子进行检测,比如MAPKs信号通路中的ERK/pERK,JNK/pJNK,PI3K/Akt信号通路中的Akt/pAkt,细胞骨架、细胞运动及细胞粘附相关分子如FAK、CAMs中的整合素和钙黏素、MMPs和Rho GTPase中的Rac1,RhoA等,探讨LRP1-SNRNP25融合基因促进骨肉瘤细胞侵袭及迁移的分子机制。然后通过质谱分析找出与LRP1-SNRNP25融合蛋白相互作用的蛋白,之后通过Western blot、免疫共沉淀(CO-IP)、以及免疫荧光实验方法进行验证。初步找到LRP1-SNRNP25下游的目的分子,使用针对该分子信号通路的抑制剂和siRNA处理LRP1-SNRNP25过表达的骨肉瘤细胞和裸鼠进一步验证,寻找LRP1-SNRNP25融合基因发挥功能所依靠的下游信号分子。结果1.HiSeq X Ten全基因组测序在DNA水平上验证了LRP1-SNRNP25的存在及其结构,LRP1-SNRNP25融合基因是由LRP1基因的8号外显子与SNRNP25基因的2号外显子融合所致。2.LRP1-SNRNP25融合基因影响骨肉瘤细胞143B和SAOS2的侵袭、迁移、远处转移能力和体内生长能力。体外实验表明,过表达LRP1-SNRNP25的骨肉瘤细胞较过表达LRP1,SNRNP25以及空载体的骨肉瘤细胞迁移和侵袭能力明显增强。体内动物实验结果显示,过表达LRP1-SNRNP25的裸鼠成瘤能力增强,瘤块增长快速且体积和重量较大,进一步使用免疫组化分析的方法结果显示过表达LRP1-SNRNP25融合基因的裸鼠成瘤的组织中Ki-67阳性细胞率明显增高,与注射过表达空载体的骨肉瘤细胞的裸鼠相比,尾静脉注射过表达LRP1-SNRNP25的骨肉瘤细胞的裸鼠发生肺转移和肝转移的几率提高。3.LRP1-SNRNP25融合基因通过pJNK/37LRP/MMP2信号通路发挥生物学效应。过表达LRP1-SNRNP25的骨肉瘤细胞较过表达LRP1,SNRNP25以及空载体的骨肉瘤细胞中pJNK、37LRP、MMP2表达增多,LRP1-SNRNP25融合蛋白与pJNK以及37LRP具有相互作用,JNK的磷酸化激活能够促进37LRP的表达。37LRP与其配体层粘连蛋白相结合之后,使其构象发生改变从而促进MMP2的大量释放。使用不同浓度梯度的JNK活性抑制剂SP600125作用后,过表达LRP1-SNRNP2的骨肉瘤细胞中37LRP以及MMP2的表达水平下降,并呈现出浓度依赖性。使用37LRP的siRNA作用后,过表达LRP1-SNRNP25的骨肉瘤细胞中MMP2的表达水平也下降。并且经SP600125、37LRP的siRNA以及MMP2的抑制剂Marimastat作用后过表达LRP1-SNRNP25的骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力明显下降。体内动物实验表明,免疫组化分析结果显示皮下种植过表达LRP1-SNRNP25的骨肉瘤细胞的裸鼠的瘤组织中pJNK以及MMP2表达明显增高,并且经SP600125处理后LRP1-SNRNP25组的裸鼠成瘤能力下降。结论LRP1-SNRNP25融合基因能够促进骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力、体内成瘤能力以及远处转移能力。LRP1-SNRNP25融合基因通过pJNK/37LRP/MMP2信号通路促进骨肉瘤细胞侵袭和迁移能力,本研究发现为LRP1-SNRNP25过表达的患者提供有意义的分子治疗靶点。