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目的:外周组织转出的胆固醇主要经高密度脂蛋白(HDL)逆向转运至肝脏代谢。HDL前体是由肝细胞合成的,肝细胞中的ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)表达增加时,HDL前体也随之增加。HDL前体入血后募集外周组织游离的胆固醇,并在血浆卵磷脂胆固醇脂酰转移酶(LCAT)作用下生成胆固醇酯,HDL成为成熟的HDL,成熟的HDL又被肝细胞膜上的HDL受体清道夫受体BI(SR-BI)识别结合后,将胆固醇转入肝细胞,发挥其特定的生物功能或转化成胆汁酸,随胆汁排出体外。胆固醇7α羟化酶(CYP7A1)是胆汁酸合成的限速酶,其活性的大小决定了胆汁酸合成的速度。研究报道,糖尿病时血总胆固醇升高,进入肝脏的胆固醇也随之增加,同时CYP7A1酶活性升高。那么,糖尿病肝脏胆固醇的摄入增多是否与肝脏ABCA1和SR-BI基因表达有关呢?糖尿病状态肝CYP7A1酶活性升高是不是因CYP7A1表达增加而引起的呢?未见报道。细胞内脂肪酸代谢主要由过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)调节,胆固醇代谢主要由肝X受体α(LXRα)调节。两个核受体对脂肪酸和胆固醇代谢调节存在交互作。糖尿病状态,脂肪动员加强,增高的游离脂肪酸可激活肝PPARα。那么,糖尿病状态PPARα被脂肪酸激活时,肝中LXRα是否也被激活?肝胆固醇相关基因的表达会不会随着LXRα的激活而改变呢?未见报道。非诺贝特是PPARα的人工合成配体,是临床常用的降脂药,它除了通过激活PPARα促进与脂肪酸分解代谢有关的酶基因表达,加强脂肪酸的分解达到降血脂的目的外,也有轻微的降血总胆固醇的作用。糖尿病时它是否通过激活PPARα进而激活LXRα,使其下游基因表达增加,从而调节胆固醇代谢,使血总胆固醇和肝胆固醇水平下降从而改善肝细胞的结构与功能?未见报道。为此,本研究一方面以链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠为实验对象,通过肝组织形态学直接观察,和血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的测定,确定糖尿病大鼠肝功能损伤的同时,观测糖尿病大鼠肝胆固醇含量;用RT-PCR方法,测定肝组织中PPARα、脂酰CoA氧化酶(ACOX1)以及LXRα、ABCA1、SR-BI、CYP7A1等与胆固醇代谢有关的基因表达情况;另一方面,观察PPARα人工合成的激活配体,降脂药-非诺贝特,对上述各项指标的影响,了解糖尿病肝胆固醇代谢情况,进一步探讨糖尿病肝脏脂代谢紊乱的分子机理,深化对糖尿病脂代谢紊乱的认识。方法:1动物分组及取材选用成年200-250g雄性清洁级Wistar大鼠,随机分为:正常对照组(CON)、糖尿病组(DM)、糖尿病+非诺贝特组(DM+F)、正常对照+非诺贝特组(CON+F)。正常大鼠一次性腹腔注射2% STZ诱导糖尿病发生。CON+F组和DM+F组在糖尿病大鼠模型建立后4周末,分别用生理盐水和非诺贝特连续两周给正常和STZ鼠灌胃(100mg/kg/day)。颈动脉采空腹血,血清用于血糖、血脂、血胆汁酸、血谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的测定。肝脏用于组织切片、RNA及脂质提取。2光镜观察组织病理变化按常规方法将肝组织用甲醛固定、石蜡包埋、切片、HE染色后,光镜观察。3肝脏总脂提取参照文献[12]提取肝脏总脂,用于胆固醇测定。4血糖、血脂、血胆汁酸、血ALT、血AST、肝胆固醇的测定上述指标用Olympus Au2700型全自动生化分析仪测定。5肝组织有关基因mRNA相对表达量的测定用Trizol法提取总RNA。以GAPDH作为内参,用RT-PCR法测定PPARα、ACOX1、LXRα、ABCA1、SR-BI及CYP7A1 mRNA的相对表达量。结果:1正常对照和糖尿病组各项指标变化1.1血AST/ALT和肝组织形态结构变化:糖尿病组血AST/ALT明显下降(1.776±0.279 vs 2.261±0.445, p<0.01);糖尿病组肝细胞排列紊乱,放射状结构消失,血窦扩张。表明,糖尿病时肝细胞结构异常,肝功能受损。1.2血脂变化:糖尿病时,血总胆固醇(1.870±0.180mmol/L vs 1.359±0.197mmol/L, p<0.01)、血HDL-C(1.308±0.188mmol/L vs 1.011±0.209mmol/L, p<0.01 )、血胆汁酸(59.626±16.349μmol/L vs 9.334±2.011μmol/L, p<0.01)、血甘油三酯(1.346±0.393mmol/L vs 0.651±0.130mmol/L, p<0.01)都明显升高。表明,糖尿病时胆固醇和甘油三酯代谢异常。1.3肝胆固醇含量的变化:糖尿病组与正常对照组肝胆固醇含量区别( 32.974±5.526mmol/mg vs 31.977±4.782mmol/mg, p>0.05)无统计学意义。1.4肝基因表达结果1.4.1肝PPARα、ACOX1 mRNA相对表达量的改变:糖尿病组和正常组相比,PPARαmRNA相对表达量(0.921±0.123 vs 0.621±0.132, p<0.01 )以及ACOX1 mRNA相对表达量(0.801±0.128 vs 0.587±0.081, p<0.01)都明显升高。表明,糖尿病时,PPARα表达增加并且被激活。1.4.2肝LXRα、ABCA1、SR-BI、CYP7A1 mRNA相对表达量的改变:糖尿病组和正常组相比,LXRα(1.216±0.128 vs 0.702±0.097, p<0.01)、ABCA1(0.725±0.127 vs 0.177±0.042, p<0.01),SR-BI(0.672±0.105 vs 0.220±0.040, p<0.01)及CYP7A1(1.137±0.212 vs 0.697±0.141, p<0.01)的mRNA相对表达均明显升高。表明,糖尿病时肝PPARα表达增加的同时,调节胆固醇代谢的核受体LXRα的表达也协同增加。HDL前体形成增多,肝脏摄入HDL-C增加,胆汁酸生成增多,胆固醇的转运、吸收和转化增强。2糖尿病+非诺贝特组和正常对照+非诺贝特组各项指标变化2.1血AST/ALT和肝组织形态结构变化:糖尿病加药组与糖尿病组(1.772±0.193 vs 1.776±0.279, p>0.05)之间,正常加药组与正常组(2.687±0.512 vs2.261±0.445, p>0.05)之间大鼠血AST/ALT变化无统计学意义;糖尿病+非诺贝特组与糖尿病组相比以及正常对照+非诺贝特组与正常组相比,肝组织结构没有明显改变。表明,非诺贝特不改变大鼠肝组织结构和功能。2.2血脂变化:除糖尿病加药组大鼠血甘油三酯( 0.743±0.269mmol/L )明显低于糖尿病组(1.346±0.393mmol/L, p<0.01)外,两组之间血总胆固醇(1.903±0.312mmol/L vs 1.870±0.180mmol/L, p>0.05)、血HDL-C(1.332±0.249mmol/L vs 1.308±0.188mmol/L, p>0.05)、血胆汁酸(56.671±29.694μmol/L vs 59.626±16.349μmol/L, p>0.05)的变化均无统计学意义;正常加药组和正常组相比,血总胆固醇( 0.979±0.156mmol/L vs 1.359±0.197mmol/L, p<0.01 )、血HDL-C ( 0.566±0.111mmol/L vs 1.011±0.209mmol/L, p<0.01 )明显下降,血总胆汁酸(30.880±9.226μmol/L vs 9.334±2.011μmol/L, p<0.01)明显升高,血甘油三酯(0.757±0.108mmol/L vs 0.651±0.130mmol/L, p>0.05)变化无统计学意义。表明,非诺贝特降低正常鼠血总胆固醇,但不降低糖尿病鼠血总胆固醇;非诺贝特不降低正常鼠血甘油三酯,但降低糖尿病鼠血甘油三酯;糖尿病鼠和正常鼠的脂代谢受非诺贝特的影响不同。2.3肝胆固醇含量的变化:糖尿病加药组肝胆固醇含量(26.167±2.937mmol/mg)明显低于糖尿病组(32.974±5.526 mmol/mg, p<0.01 );正常加药组肝胆固醇含量( 24.417±1.429mmol/mg )明显低于正常组(31.977±4.782mmol/mg, p<0.01)。表明,非诺贝特能降低大鼠肝胆固醇水平。2.4肝基因表达结果2.4.1肝PPARα,ACOX1 mRNA相对表达量的改变:糖尿病加药组与糖尿病组(0.784±0.138 vs 0.921±0.123, p>0.05)以及正常加药组与正常组(0.651±0.133 vs 0.621±0.132, p>0.05)之间PPARαmRNA相对表达量变化均无统计学意义。糖尿病加药组ACOX1 mRNA相对表达量(1.253±0.125)明显高于糖尿病组(0.801±0.128, p<0.01),正常加药组ACOX1 mRNA相对表达量(1.273±0.194)明显高于正常组(0.587±0.081, p<0.01)。表明,非诺贝特激活了正常大鼠和糖尿病大鼠肝PPARα。2.4.2肝LXRα、ABCA1、SR-BI、CYP7A1 mRNA相对表达量的改变:糖尿病加药组与糖尿病组之间,LXRα(1.090±0.087 vs 1.216±0.128, p>0.05)、ABCA1(0.809±0.050 vs 0.725±0.127, p>0.05)和SR-BI(0.554±0.081 vs 0.672±0.105, p>0.05)的mRNA相对表达量变化均无统计学意义;糖尿病加药组CYP7A1 mRNA相对表达量(1.399±0.149)明显高于糖尿病组(1.137±0.212, p<0.01)。正常加药组和正常组相比,LXRα(0.944±0.189 vs 0.702±0.097, p<0.01)、ABCA1(0.807±0.131 vs 0.177±0.042, p<0.01)、SR-BI(0.540±0.140 vs 0.220±0.040, p<0.01)以及CYP7A1 (1.038±0.116 vs 0.697±0.141, p<0.01)的mRNA相对表达量均明显升高。表明,非诺贝特对糖尿病鼠和正常鼠基因表达的影响不同。结论:1糖尿病时,大鼠肝PPARα的激活伴随LXRα的激活。糖尿病肝脂肪酸代紊乱时,与胆固醇代谢有关的基因表达也出现异常。2非诺贝特对糖尿病鼠肝胆固醇代谢相关基因mRNA表达影响不同于正常鼠。在我们实验条件下,它虽然可以降低糖尿病鼠肝胆固醇水平,但不能降低糖尿病鼠血总胆固醇。