现代战争可导致大量爆炸性脑损伤、战创伤，其死亡率高，严重危害战士的身体和精神健康。爆炸性脑损伤后带来的继发性脑损害大部分不适合手术治疗，同时又经常伴随着严重的血脑屏障代谢障碍，水电解质平衡、中枢体温、颅内压调节等功能的异常，使机体应激和抵抗能力下降，死亡率剧增，严重危害我军士兵的作战能力，目前其相关防治措施和药物的研究仍处于空白状态。传统药物治疗效果差、毒副作用大，因此研制出临床应用前景广泛、高效、低毒的颅脑战、创伤后神经保护药，已经成为我军急需解决的问题。　　Homer-1a蛋白分子作为 Homer蛋白家族中一员，属于突触后致密物质（post synaptic density，PSD）的一种，与多种疾病的发生发展都有联系。Homer-1a与Shank、ERK等分子发生相互作用，通过调控PSD之间的信号传导，从而影响多种细胞分子的功能。我们实验团队发现Homer-1a可通过调控自由基、炎性因子、凋亡等信号通路减轻脑损伤，具有明显的神经保护作用。通过 RT-PCR从鼠和人类cDNA基因库中扩增出Homer-1a的cDNA，采用基因工程技术制备了Homer-1a蛋白，模拟爆炸性脑损伤，经初步的体外细胞毒性试验表明，Homer-1a具有很强的神经保护作用，显示出较好的临床应用前景。　　实验一：颅脑爆炸伤模型的建立　　目的：建立一种稳定，可重复的，安全可靠的用以模拟原发性冲击波损伤的大鼠颅脑爆炸伤（blast-induced traumatic brain injury，颅脑爆炸伤，bTBI）模型，为进一步研究bTBI后脑组织损伤的机制及干预因素提供基础。　　方法：应用两种微型球形爆炸源，其一：直径2.5mm*当量15.6mg TNT；其二：直径　　3.0mm*当量27.0mg TNT）。将雄性SD大鼠120只随机分为对照组（Control groμp，Con）、中度损伤组（Moderate injμry即2.5mm组）和重度损伤组（Severe injμry即3.0mm组），每组40只，中度和重度损伤组分别按损伤后6h，12h，24h和3d时间点进行取样，每组10只。大鼠麻醉后将微型炸药球放置于使微型炸药置于大鼠右侧额叶头皮上方2mm处（失状缝与人字缝中点偏右3mm），用交流电引爆电雷管，银制柔性导爆索的传导从而引爆爆炸源，分别造成中度和重度损伤。爆炸伤后对大鼠进行死亡率和 NSS评分检测，同时进行脑组织石蜡切片的HE染色和TUNEL染色。　　结果：对照组大鼠脑组织HE染色可见皮质及海马的细胞结构完整，排列紧密，神经元的细胞核呈圆形或者椭圆形，蓝色深染，清晰可见，未见到病理损伤。中度损伤组中未见死亡的大鼠，但经过爆炸损伤后，NSS评分提示大鼠的神经功能严重损伤，同时存在着严重的硬膜下血肿和蛛网膜下腔出血，大脑皮层中微血管破裂出血，脑挫裂伤程度均一。通过 HE染色，可见大鼠脑组织受损区域中存在着大片的神经元坏死，其形态为核淡染，肿胀，固缩及碎裂等，偶见白细胞及单核-吞噬细胞。bTBI6h后，在大鼠脑组织的损伤区及其周围皮层出现了大量的凋亡细胞。重度损伤组大鼠的死亡率为35％，大体标本上可以看出颅脑损伤严重， HE染色可见大鼠受损皮层中神经元的数量严重下降、胞质伊红染色明显增强、胞核固缩深染、形态不规则、核仁不清晰或消失，NSS评分高，凋亡细胞数多，与中度损伤组相比，存在着明显的差异（*p＜0.05）。　　结论：重度损伤组中造成的损伤过于严重，大鼠死亡率过高，不适宜进行后续实验。采用2.5mm的爆炸源的中度损伤组可以很好模拟冲击波的原发效应，也兼顾了实验的稳定性及可重复性，是大鼠bTBI模型的最佳选择。　　实验二：Homer-1a基因原核表达载体构建　　目的：以鼠源和人源 Homer-1a基因（Mus-Homer1a和 Homo-Homer1a）为模板，分别设计构建了七个表达载体，其中四个含 His编码基因，三个不含His编码基因。其中五个带含有穿膜肽（cell penetrating peptide，CPP），方便把目的蛋白带入细胞。建立带HIS标签的His-Mus-Homer1a重组蛋白工程菌菌种库和质粒库。　　方法：生化反应分析、扫描电镜观察、DNA电泳、蛋白电泳、Westernbolt以及DNA测序分析。　　结果：大肠杆菌主要以上清形式表达 His-Mus-Homer1a重组蛋白，经过50代传代后其遗传性状和蛋白表达性状未变，稳定性高。　　结论：成功构建了七个表达载体，其中四个表达载体（ pET28a-His-Mus-Homer1a、pET28a- CPP-Homo-Homer-1a、pET28a-His-CPP-Mus-Homer1a和 pET28a-His-CPP-Homo-Homer-1a质粒）含 His编码基因，三个不含 His编码基因，为下一步的诱导、表达、纯化奠定基础。　　实验三：Homer-1a蛋白表达、鉴定及纯化　　目的：通过对大肠杆菌进行诱导表达、分离纯化，从而得到高纯度的重组 His-Mus-Homer-1a蛋白。　　方法：通过对表达载体的大肠杆菌进行不同温度（37℃、30℃和25℃）、不同浓度（0mol/L、0.1mol/L、0.5mol/L和1.0mol/L）和不同时间（0、2、4和6小时）IPTG诱导表达，Western Blot对蛋白的鉴定，发酵罐发酵，Ni柱亲和纯化。　　结果：实验发现在29KD附近， Homer-1a菌种在37℃， IPTG浓度为0.1ml/L、0.5ml/L、1ml/L的情况下都有蛋白表达，上清中表达量远远高于沉淀。同时发现在37℃，1mol/L的IPTG情况下，诱导6小时的菌种有较高的Homer-1a蛋白的表达，沉淀中的蛋白表达远远低于上清；在37℃、30℃、25℃，IPTG浓度为1mol/L的情况下，37℃的时候 Homer-1a蛋白有较高蛋白表达率，上清表达高于沉淀表达。通过 Ni柱亲和层析纯化的方法得到了纯度在95%以上的His-Mus-Homer1a重组蛋白。　　结论：成功得到了纯度在95%以上的His-Mus-Homer1a重组蛋白，为下一步的活性检测奠定基础。　　实验四：Homer-1a蛋白在离体TBI中作用　　目的：考虑到离体bTBI模型很少，bTBI和创伤性颅脑损伤（traumatic brain injury，TBI）在机制上有很多相似性，因此通过离体 TBI的实验，初步探索重组蛋白Homer1a在TBI中的作用，为探索Homer1a在bTBI中的作用奠定基础。　　方法：在离体划伤的神经元细胞中分别加入低浓度（5μmol/L，L-Homer-1a）和高浓度的Homer1a重组蛋白（10μmol/L，H-Homer-1a），通过 LDH和TUNEL实验观察其对TBI的作用。　　结果：高浓度 Homer-1a（10μmol/L）可以显著降低 LDH的量，与 TBI和 PBS+TBI组相比具有显著性差异（*P<0.05），高浓度 H-Homer-1a（10μmol/L）可以显著降低神经元的凋亡数量，与TBI和PBS+TBI组相比具有显著性差异（*P<0.05）。　　结论：初步确定重组蛋白 Homer1a在 TBI中具有神经保护作用，其机制有待进一步研究。