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恶性肿瘤的基因治疗在实验中已经取得了非常大的突破，但是在临床应用上始终难以被接受和推广。作为一种治疗方案，有效性和安全性同样重要。目前众多的基因治疗方案对抑制肿瘤细胞生长都非常有效，但同时也会伤及正常细胞。靶向性差已成为恶性肿瘤基因治疗发展过程中的一大瓶颈。靶向性的含义包括治疗基因转移靶向性和表达靶向性两个方面。治疗基因的表达又可以在基因活化、转录、转录后、翻译和翻译后等多个层面上得到调控。
人端粒酶逆转录酶启动子（human telomerase reverse transcriptase promoter，hTRTP）因其具有肿瘤特异的转录特性而倍受关注，但是它的转录活性还有待提高。本研究通过人工改造hTRTP以期获得高效及高特异性的hTRTP优化形式。人缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）是一种在缺氧的肿瘤细胞内富集的转录因子。其α亚基－HIF-1α肽链中部的氧依赖降解结构域（oxygen-dependent degradation domain，ODD domain）能感受细胞内氧分压进而调节HIF-1的稳定性。我们通过将肿瘤抑制基因（human WW-domain containing oxidoreductase，hWWOX）与HIF ODD结构域序列连接，构建融合蛋白hWWOX`-linker-HIF ODD，希望该融合蛋白在保持原肿瘤抑制功能的同时带有氧依赖降解特性，达到在常氧的正常细胞内快速降解，而专一地在缺氧的肿瘤细胞内稳定存在，发挥杀伤作用的目的。在优化的hTRTP的转录调控和融合蛋白hWWOX`-linker-HIF ODD的翻译后调控下，尝试一种肿瘤基因治疗的双调控策略。实验包括以下三部分内容：
一．人端粒酶逆转录酶启动子（hTRTP）的转录活性改造
用PCR方法从pGL3-Basic-TRTP207载体上扩增230bp的hTRTP230，该片段中含有与hTRTP的转录活性密切相关的“E-box－5×GC-box－E-box”序列，按不同拷贝数插入pGL3-Basic-TRTP207后，构建pGL3-Basic-TRTP207-2和pGL3-Basic-TRTP207-3。同时扩增237bp的hTRTP230-TATA，同样插入pGL3-Basic-TRTP207后，构建pGL3-Basic-TRTP207-TATA。将以上四种报告基因载体（pGL3-Basic-TRTP207、pGL3-Basic-TRTP207-2、pGL3-Basic-TRTP207-3和pGL3-Basic-TRTP207-TATA）瞬时转染肿瘤细胞A549、Hela、HepG2、Hep3B及正常细胞WI-38，荧光素酶活性检测显示：构建的三种hTRTP新形式（TRTP207-2、TRTP207-3和TRTP207-TATA）的转录活性均有不同程度提高，其中TRTP207-3活性最高。TRTP207-2和TRTP207-3在转录活性提高的同时仍然保留了肿瘤专一的转录特性；而TRTP207-TATA丧失了转录特异性，在正常细胞WI-38中强烈驱动荧光素酶表达。故TRTP207-3可以用作下一步实验。
二．含有HIF ODD结构域的融合蛋白的构建及其氧依赖降解特性的研究
用PCR方法克隆了HIF-1α的HIF ODD结构域，将其融合至两种报告基因EGFP和luc的羧基端。构建的融合蛋白EGFP`-linker-HIF ODD和luc`-linker-HIF ODD在常氧环境下能迅速降解；在1％O2环境中稳定存在。在此预实验基础上构建了表达载体pcDNA3.0-hWWOX`-linker-HIF ODD，在转染后24小时用RT-PCR和Western Blot检测A549、Hela、HepG2和Hep3B细胞内该载体的表达情况，发现融合基因hWWOX`-linker-HIF ODD的mRNA水平在常氧和缺氧培养的细胞内没有明显区别，但是常氧组细胞内的融合蛋白水平显著低于缺氧组细胞，提示融合基因hWWOX`-linker-HIF ODD的表达在翻译后水平受氧分压的调控，融合蛋白hWWOX`-linker-HIF ODD具有良好的氧依赖降解特性。同时，对caspase-9 、caspase-3激活状态的检测、MTT和单克隆形成试验，都显示：和阳性对照hWWOX蛋白相比，在常氧培养的细胞内表达的hWWOX`-linker-HIF ODD融合蛋白因降解而不能诱导受试细胞凋亡，抑制细胞生长的作用也明显下降。
三．双调控的腺病毒载体治疗肺癌的实验研究
利用第一、二部分实验中的最优化启动子TRTP207-3和融合基因hWWOX`-linker-HIF ODD，构建了肿瘤特异性受缺氧调控的腺病毒Ad- TRTP207-3-hWWOX`-linker-HIF ODD-BGHpA（Ad-TWLHB）和对照腺病毒Ad- TRTP207-3-luc`-linker-HIF ODD-BGHpA（Ad-TLLHB）。Western Blot检测显示：由腺病毒介导的hWWOX`-linker-HIF ODD融合蛋白依然能够正确表达，且保持了氧依赖降解特性。对caspase-3激活状态及Annexin-V-FITV/PI双标检测显示：缺氧环境下表达并稳定存在于A549、Hela、HepG2、和Hep3B细胞内的hWWOX`-linker-HIF ODD融合蛋白具有明显诱导细胞凋亡的活性。在A549荷瘤裸鼠模型上观察到，与注射Ad-TLLHB的对照组动物相比，注射Ad-TWLHB的实验组动物瘤体生长明显受抑。