目的:肝脏是人体重要的解毒器官，当人体摄入大量的化学药物时将发生肝细胞坏死，甚至导致急性肝衰竭。为了深入研究急性肝损伤发生的分子机制，建立急性肝损伤的动物模型是十分必要的，用四氯化碳(CCl4)给鼠灌胃造成的肝损伤动物模型长期应用于肝损伤的研究领域，但CCl4引起肝损伤的机制尚未完全阐明。目前一般认为，四氯化碳在肝细胞微粒体内，在酶的作用下，碳氢键发生断裂产生自由基，自由基可以激发细胞生物膜上脂质的多价不饱和脂肪酸发生过氧化反应，产生脂质过氧化物。脂质过氧化反应是链锁式的，连续不断地进行，消耗大量脂质，产生大量脂质过氧化物，造成细胞生物膜的损害，严重者可导致细胞崩溃，使肝脏遭受损害。平贺等在CCl4诱导急性损伤24到72小时的鼠肝脏细胞浆中发现了一种30kDa的蛋白，经免疫蛋白印迹确定为galectin-3(Gal-3)，并与酪氨酸残基发生磷酸化。该时相的肝细胞浆或核内表达p21(WAF1/Cip1/Sdi1)和PCNA蛋白，提示galectin-3在肝损伤24到72h时可能参与肝细胞的修复和生存。Gal-3是一个分子量为30kDa的β-半乳糖血凝素超家族成员，存在于所有的胚胎细胞和肿瘤细胞中，正常成体细胞不表达，现在虽然知道她具有很多功能，但除细胞黏附、细胞运动和作为advancedglycationendproduct受体(RAGE)的功能外，在分子水平其功能的研究很少。而Gal-3在肝损伤中的作用机制研究更少，因此有必要研究Gal-3在肝损伤中的作用机制。 为了探讨galectin-3在CCl4肝损伤中作用机制，给Gal-3基因敲出(Gal-3(-/-)鼠和野生型(Gal-3(+/+))鼠CCl4灌胃、以凋亡表达的调控蛋白酶及分子伴侣GRP78做为指标观察不同时间点分子水平表现型的变化，探讨galectin-3在CCl4肝损伤中抗凋亡机制。 大量研究表明Gal-3通过含半乳糖苷的胍基乙酸内酰胺与靶分子结合参与细胞信号传导途径。寻找与Gal-3结合的高分子物质成为探讨Gal-3在肝损伤过程中分子生物学意义的一个基础问题。我们在用抗Gal-3抗体进行免疫蛋白印迹实验中发现，在野生鼠CCl4灌胃后有一65kDa大小蛋白与Gal-3的表达有密切关系，即在24小时到72小时间高表达，为弄清该蛋白的性质，本实验通过层析分离，寻找并分离纯化一种Gal-3复合体，为进一步深入研究提供方向。 实验方法:1.实验动物野生(Gal-3(+/+))型ICR雄性健康小鼠，10周龄，日本国立肿瘤研究所提供。galectin-3基因敲出(Gal-3(-/-))型ICR雄性健康小鼠，10周龄，日本富山医科药科大学生化学第一研究室提供。 12.CCl4灌胃致小鼠肝损伤10周龄ICR雄性健康小鼠(Gal-3(+/+)型和Gal-3(-/-)型)，分别随机分成0、10、24、48、72小时组饲养，每组l0只。染毒前禁食12小时，将CCl4与食用橄榄油等重混合制备灌胃液，按8ml/kg体重给小鼠灌胃。灌胃后立即给食正常饲养。 3.小鼠肝组织病理切片制备及观察将CCl4灌胃后0、10、24、48、72小时的小鼠乙醚麻醉，心脏取血后断头处死，迅速取出肝脏，用生理盐水将血液洗去，用小剪刀将小鼠肝脏分成两份。 用小刀将其中一份小鼠肝组织切成1cm×1cm×0.3cm小块，立即用100ml/L的中性福尔马林固定32小时，这些组织小块在一系列逐级上升的酒精中脱水，并随后在二甲苯中清洗，包埋于石蜡中用切片机切成5μm厚的切片。制备成HE染色肝组织切片。 光学显微镜下观察肝组织病理变化，计数正常细胞核和异常细胞核，肝组织切片在放大倍数400倍的显微镜下观察，可以明显鉴别出正常细胞核和含有染色体凝聚碎片的异常细胞核。正常细胞核和异常细胞核的数量是由两位独立的观察者计数，由联接在一台显微镜上的电脑上的运行软件“立体调查者”统计正常细胞核和异常细胞核数目。每组抽取10只小鼠，每只小鼠随机抽取10个切片进行细胞核计数。每个切片由软件随机自动最优化选取选取9个面积为100μm×100μm的计数区。每组的异常细胞核的百分率(异常细胞核的数目/总细胞核的数目×100％)随即计算出来。用卡方检验相同时间组的野生型和Gal-3基因敲出型鼠肝组织切片的异常细胞核百分率的差异。 4.小鼠肝细胞组份的分级分离将另一份肝组织置于小平皿中(4℃，以下操作均在4℃的低温室里进行)，用小剪刀将小鼠肝组织剪成小碎块，称重后转移到组织匀浆管中，按9ml/g肝组织重量加入0.25M蔗糖缓冲液，经电动研杆研磨为匀浆。将每只鼠肝的匀浆液经纱布过滤，保存滤液备用。此滤液为肝细胞研磨液(HO)，将此滤液转移到离心管中，置4℃离心机中离心，6000g10分钟，沉淀为细胞核组份(Nuc)，取上清进行(4℃)离心，8000g10分钟，沉淀为细胞线粒体组份(Mt)，取上清液进行超速离心，4℃，105000g60分钟，沉淀为细胞微粒体组份(Mic)，上清液为肝细胞基质组份(Cyt)。将分离的各细胞组份置-80℃冰箱保存。 5.蛋白印迹法的检测及记录采用BCA蛋白定量检测试剂对小鼠肝细胞研磨液组份、细胞核组份、线粒体组份、肝细胞基质组份和微粒体组份进行总蛋白定量，按总蛋白均衡各组份上样体积(5-20μl)，进行SDS-PAGE电泳，电泳后在电转移槽中将凝胶中的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，用含5％牛奶的TBST室温封闭1h，将转印膜加入第一抗体室温孵育1h，除去抗体孵育液，用TBST液洗膜3次，每次5min。将转印膜加入第二抗体室温孵育1h，除去抗体孵育液，用TBST液洗膜3次，每次10min。加入ECL蛋白印迹检测分析试剂，在化学冷光影像分析仪(LAS-1000plus)中30分钟化学发光反应显影、摄影记录。将免疫蛋白印迹显影图像扫描，利用BandLeaderV3.0图像分析软件对实验结果进行分析，单位面积上扣除背景后的平均光密度值(MOD)代表酶含量，用t检验，比较相同时间、相同细胞组份的Gal-3基因敲出型跟野生型鼠的免疫蛋白印迹结果的差别。 6.血清ALT、AST酶活性检测将取出的血液在2000rpm离心10分钟，分离血清。用InfinityTMALT试剂和InfinityTMAST分别检测鼠血清中ALT、AST酶活性。将相同时间组的Gal-3基因敲出型和野生型鼠的血清ALT及AST活性均值进行t检验。 7.Galectin-3复合体的分离纯化将CCl4灌胃后48小时野生型鼠肝细胞匀浆液经DE-52柱层析、Hydroxyapatite柱层析、盐析和脱盐、SephacrylS-300凝胶层析后分离纯化一种分子量为65kDa的Galectin-3复合体蛋白。 结论:1.CCl4引起Gal-3(-/-)小鼠肝损伤比野生型小鼠肝损伤出现时间早、损伤程度严重，Gal-3(-/-)小鼠肝损伤时，异常细胞核百分率、ALT、AST均高于野生型小鼠，提示Gal-3可能在CCl4肝损伤过程中有保护肝细胞减缓损伤的作用。 2.野生型小鼠肝损伤时肝细胞微粒体中GRP78的表达明显高于Gal-3(-/-)小鼠，说明Gal-3可能通过上调GRP78的表达参与肝细胞损伤的修复作用，是其作用机制之一。 3.Caspase3、Caspase7与PARP在Gal-3(+/+)和Gal-3(-/-)小鼠受损肝细胞的相似表达，提示galectin-3可能通过调节Caspase3和Caspase7以外的途径参与凋亡的调节，保护肝细胞和修复肝损伤。 4.新发现的分子量为65kDa的蛋白可能是Gal-3的一种复合体。